JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعبير مغايرة وتنقية التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) هي تحديات كبيرة والعوامل التي تحول دون تطوير علاجات المخدرات للكشف عن التليف الكيسي. يصف هذا البروتوكول طريقتين لعزل كميات مليغرام من CFTR مناسبة للدراسات الفنية والهيكلية.

Abstract

عيوب في الكيسي منظم عبر الغشاء التليف تصرف (CFTR) البروتين يسبب التليف الكيسي (CF)، وهو مرض وراثي جسمي مقهور التي تحد حاليا متوسط ​​العمر المتوقع للمرضى إلى <40 سنة من العمر. تطوير جزيئات المخدرات رواية لاستعادة النشاط من CFTR هو هدف مهم في CF العلاج، وعزل CFTR نشطة وظيفيا هو خطوة مفيدة نحو تحقيق هذا الهدف.

نحن تصف طريقتين لتنقية CFTR من نظام تعبير مغايرة حقيقية النواة، S. الخباز. مثل أنظمة بدائية النواة، S. خميرة يمكن زراعتها في المختبر بسرعة وبتكلفة منخفضة، ولكن أيضا حركة المرور وposttranslationally يمكن تعديل البروتينات الغشاء كبيرة. اختيار المنظفات لإذابة وتنقية هو خطوة حاسمة في عملية تنقية أي بروتين الغشاء. بعد فرزهم للذوبان CFTR في عدة المنظفات، فقد اخترنا رئيسينntrasting المنظفات لاستخدامها في تنقية تسمح إعداد CFTR النهائي ليكون متلائما مع التجارب المخطط لها في وقت لاحق.

في هذه الطريقة، ونحن نقدم مقارنة تنقية CFTR في دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) و 1 tetradecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات (1'-RAC-الجلسرين) (LPG-14). البروتين المنقى في DDM بهذه الطريقة يظهر النشاط أتباز في المقايسات الفنية. البروتين المنقى في LPG-14 يظهر نقاء عالية والغلة، ويمكن استخدامها لدراسة التعديلات بعد متعدية، ويمكن استخدامها لأساليب الهيكلية مثل زاوية صغيرة تشتت الأشعة السينية والمجهر الإلكتروني. ومع ذلك فإنه يعرض أقل بكثير النشاط أتباز.

Introduction

التليف الكيسي (CF) هو اضطراب وراثي الأكثر شيوعا في أوروبا وأمريكا الشمالية مع حدوث حوالي 1 في 2،500 ولادة حية. يحدث عندما CF الطفرات في الكيسي منظم عبر الغشاء التليف تصرف (CFTR) بروتين يسبب فقدان وظيفتها في الغشاء البلازمي للخلايا الظهارية 1. نتيجة أخطر من هذا العيب هو الضرر الرئة لا رجعة فيه، والذي يقصر العمر المتوقع للمرضى إلى <40 سنة من العمر 2،3.

CFTR هو الكاسيت ATP ملزم (ABC) نقل التي تطورت لتصبح 1،4 القناة الايونية. على الرغم من وظيفتها غيرت تماما في غشاء البلازما من الخلايا، فإنه لا يزال يحتفظ تناظر تسلسل كبيرة مع النقل ABC الأخرى. يثير الاهتمام والفضول، وأجزاء المتخصصة CFTR (أي منطقتها التنظيمية والتي وN-C-تيرميني) تبادل جود تشابه كبير مع تسلسل metazoan أخرى نقل ABC، وبالتالي ليست هناك أدلة إلى الأصول (ه) من هذه المتتاليات في CFTR. على أساس الهيكل الأساسي، وتصنف CFTR كعضو C-عائلة من عائلة نقل ABC، ولكن ليس هناك أدلة قوية على وجود صلة وظيفية المتبقية لهذه الأسرة الفرعية. كانت هناك بعض التقارير عن نشاط النقل الجلوتاثيون لCFTR 5-7، والتي سيكون متسقا مع أدوار أعضاء الأسرة الآخرين C-8،9، على الرغم من أن تقارير أخرى تشير إلى أن انخفاض الجلوتاثيون قد تمنع نشاط CFTR أتباز، بدلا من إظهار التحفيز التي يسببها الركيزة التي تميز النقل ABC 10. قياس أيون تصرف حساسة بما فيه الكفاية للسماح للقناة النشاط من الجزيئات CFTR واحد لدراستها 1 وتم رصدها خصائص القناة CFTR بوصفها وظيفة من الوقت ودرجة الحرارة، وتركيز ATP، غشاء المحتملة، والدولة الفسفرة، وكذلك في بحضور مجموعة من مثبطات جزيء صغير، potentiators، والمعدلات. هؤلاءوأضافت الدراسات أيضا إلى حد كبير في معرفتنا كيف تعمل شركات النقل ABC. ومع ذلك، فقد ثبت التعبير عن CFTR بكميات كبيرة وتنقية لاحقة لتكون تحديا من نوع خاص، وقد تم نجاح تقتصر على عدد قليل من المختبرات 10-13.

الحاجة إلى تطوير عقاقير أكثر فعالية والضغط، ولكن تم عرقلة هذه العملية من خلال عدم وجود CFTR تنقيته لفحص الجزيئات الصغيرة. أن حل مشكلة التعبير CFTR وتنقية تمكين فحص المخدرات عالية الإنتاجية التي تهدف إلى تصحيح الخلل الأساسي في CF وسيفتح أيضا طريقا للدراسات الهيكلية عالية الدقة لإبلاغ تصميم الأدوية العقلاني. وعلاوة على ذلك، لا تزال حتى الخصائص الكيميائية الحيوية الأساسية نسبيا من البروتين، مثل حالته من oligomeric وظيفية، والبروتينات التفاعل والنشاط أتباز سيئة تتميز. لقد ذكرت سابقا بروتوكول للتعبير على نطاق واسع من GFP وصاحب الموسومة CFTR الفئرانفي S. الخباز 14 والآن مزيد تصف بروتوكولات لتنقية CFTR. وقد استخدمنا هذه الطرق لتنقية خمسة orthologues من CFTR، والبيانات الحالية لتنقية CFTR الدجاج كمثال على ذلك. اختيار المنظفات لإذابة وتنقية هو خطوة حاسمة في عملية تنقية أي بروتين الغشاء. بعد فرزهم للذوبان CFTR في عدة المنظفات، فقد اخترنا اثنين من المنظفات المتناقضة لاستخدامها في تنقية. دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) هو المنظفات غير أيوني التي استخدمت على نطاق واسع للدراسات الهيكلية والوظيفية على حد سواء من بروتينات الغشاء 15-21. المنظفات الأيونية 1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات (1'-RAC-الجلسرين) (LPG-14) هو كفاءة عالية في الانحلالية من CFTR وسبق استخدامها في تنقية البروتينات الغشاء وظيفية 10، 22،23، بما في ذلك تنقية CFTR من S. الخباز 24.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة

  1. لجعل الأسهم 100X من مثبط البروتياز (PI) 96 مغ كوكتيل حل AEBSF، 3.5 ملغ chymostatin، 10 ملغ E64، 16.5 ملغ leupeptin، 16.5 ملغ pepstatin، 348 ملغ PMSF، و 4 ملغم bestatin في 20 مل DMSO. جعل 1 مل مأخوذة وتخزينها في -20 درجة مئوية. لجعل الأسهم 100X من benzamidine، حل 720 ملغ في 20 مل الماء عالى النقاء ([ده 2 O) وتخزينها في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية. هذه الكمية تكفي لتنقية واحدة. في جميع مخازن، وتستخدم الأسهم PI وbenzamidine في التخفيف 1:100.
  2. إعداد 'mPIB' (0.3 M تريس الرقم الهيدروجيني 8، 0.3 M السكروز، 2 مم DTT) و 'CFTR "(50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 20٪ (V / V) الجلسرين، 1 ملم DTT) مخازن والبرد إلى 4 ° C . قبل الاستخدام، إضافة 1:100 من كوكتيل مثبط البروتياز و1:100 benzamidine وفقا لحجم mPIB تستخدم لresuspend الكرية خلية (على سبيل المثال، استخدم 3.5 مل و 3.5 مل PI benzamidine في إجمالي حجم 350 مل mPIB).
  3. إعداد وolubilization المخازن المؤقتة. الانحلال الفوسفاتيديل الجلسرين-14 (LPG) الانحلالية العازلة (50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 10٪ (V / V) الجلسرين، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، مثبطات الأنزيم البروتيني (حزب القانون والعدالة) و 4٪ (ث / ت) LPG) ومالتوزيد دوديسيل (DDM) الانحلالية العازلة (50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 20٪ (V / V) الجلسرين، 1 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، مثبطات الأنزيم البروتيني، 4٪ (ث / ت) DDM). العازلة يمكن و sonicated في sonicator باث (35 W، 40 كيلو هرتز) للمساعدة في تشتيت المنظفات، ولكن تجنب vortexing لخليط، وهذا يخلق فقاعات. البرد إلى 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  4. CFTR العازلة تنقية لتنقية غاز البترول المسال هو 50 ملي تريس، 10٪ (V / V) الجلسرين، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، 0.1٪ (ث / ت) LPG-14 ومثبطات الأنزيم البروتيني. إعداد 350 مل من هذا المخزن المؤقت، و 150 مل من المخزن نفسه زائد 1 M إيميدازول. ضبط درجة الحموضة لكل من المخازن المؤقتة إلى 8.
  5. المخزن المؤقت لتنقية في DDM يتكون من 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 20٪ (V / V) الجلسرين، 1 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، 0.1٪ (ث / ت) DDM. إعداد 350 مل من هذا المخزن المؤقت، و 150 مل من المخزن نفسه زائد 1 M imidazoجنيه. ضبط درجة الحموضة لكل من المخازن المؤقتة إلى 8.
  6. لهلام تخلل اللوني (GPC) العازلة التي تحتوي على غاز البترول المسال، وإعداد 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 10٪ (V / V) الجلسرين، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، 0.05٪ (ث / ت) LPG-14. لحزب المؤتمر الشعبي العام باستخدام DDM إعداد العازلة من 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8، 20٪ (V / V) الجلسرين، 1 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، 0.1٪ (ث / ت) DDM. يجب أن تتم تصفيته جميع مخازن وده 2 O المستخدمة في العمود المؤتمر الشعبي العام (0.2 ميكرون فلتر) وdegassed قبل الاستخدام.
  7. العازلة عينة SDS-PAGE (2X تركيز العمل): 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 5٪ (V / V) الجلسرين، 5 ملي EDTA، 0.02٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق. جعل 700 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، إضافة 200 ميكرولتر من 20٪ (ث / ت) دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، و 100 ميكرولتر من الطازجة 0.5 M DTT. احتضان لمدة 10 دقيقة على الأقل مع العينة في درجة حرارة الغرفة قبل تحميل على هلام. لا تسخن؛ هذا سوف تفسد GFP ويمكن أن يتسبب CFTR لتجميع.
  8. لجعل مخزون الدهون لإعادة، ويحل 4:1 (ث / ث) خليط من E. القولونية الدهون ود (2:1 ت / ت) الكولسترول في الكلوروفورم والميثانول، وجاف في قارورة زجاجية تحت N 2 الغاز لمدة 2 ساعة لتشكيل الفيلم الدهون. إضافة GPC العازلة (مع عدم وجود كلوريد الصوديوم) إلى تركيز الدهون من 40 ملغ / مل واستخدام vortexing لتكرار وصوتنة (35 W، 40 كيلو هرتز) لتوضيح الحل.
  9. لفحص أتباز، وإعداد 100X مخزونات مثبطات أتباز عن طريق إذابة SCH28080 إلى 1 ملم في DMSO، NaSCN إلى 1 M في DDH 2 O وأوليغوميسين إلى 2.5 ملم في 100٪ (V / V) الايثانول. متجر في aliquots في -20 درجة مئوية. جعل 100 مل من العازلة أتباز مع 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 ملي NH 4 CL، 5 ملي MgSO 4 و 0.02٪ (ث / ت) نان 3. هذا ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة وتستخدم لعدة فحوصات. إعداد الأسهم 5 ملي ATP مباشرة قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد. (ملاحظة: استخدام نا 2 ATP لمنع إشارة الخلفية المفرط من الفوسفات في مقايسة). إعداد الحل SDS توقف (12٪ (ث / ت) SDS في DDH 2 O).
  10. للكشف شيفليت إعداد العازلة A (3٪ (ث/ ت) أسكوربات، 0.5٪ (ث / ت) كربونات الأمونيوم، حمض الهيدروكلوريك 0.5 M) فورا قبل الاستخدام والعازلة B (2٪ (ث / ت) سيترات الصوديوم، 2٪ (ث / ت) الصوديوم الفوقية الزرنيخ، 2٪ (ت / ت) وحامض الخليك).

2. عزل Microsomes الخميرة

  1. تزرع S. الخباز معربا عن CFTR الدجاج كما هو موضح في O'Ryan وآخرون (2012) 14. تخزين المواد من 20 L التخمير في اثنين aliquots في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. تذويب قسامة واحدة من الخلايا بسرعة و resuspend في 3 مل mPIB مبردة في كل غرام من الخلايا.
  3. تعطيل الخلايا في مطحنة حبة باستخدام الخرز الزجاجي من 425-600 ميكرون القطر. استخدام خمس فترات 1 دقيقة من تمزيق الخلايا مفصولة فترات الراحة 1 دقيقة. (وفترات الراحة ضرورية للتأكد من أن الخلايا لا يسخن أثناء انقطاع.)
  4. رصد تمزيق الخلايا بواسطة الطرد المركزي لعينة 1 مل من المحللة خلية من طاحونة حبة. الطرد المركزي (12،000 x ج، 4 درجة مئوية، 5 دقائق) في المرك مقاعد البدلاء الأعلىifuge. تمييع طاف ل01:50 مع mPIB في كفيت وقياس A 380. إذا كانت A 380> 0.1، أو توقف زيادة على الرغم من عدة دورات حبة الضرب المتكرر، انتقل إلى الخطوة التالية. إن لم يكن، كرر 2،3-2،4.
  5. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة مجموعه (12،000 س ز، 4 ° C، 20 دقيقة). الاحتفاظ طاف. تجاهل بيليه (التي تحتوي على خلايا غير منقطعة والميتوكوندريا)، ولكن إذا كان هناك أي شك حول كفاءة الخلية الكسر (انظر 2.4)، ثم الإبقاء على بيليه أيضا.
  6. أجهزة الطرد المركزي لطاف من الخطوة السابقة (200،000 x ج، 4 درجات مئوية، 1.5 ساعة). تجاهل طاف و resuspend الأغشية العازلة في الميكروسومي مكعبات CFTR. إذا المقصود من microsomes لتنقية باستخدام DDM، تكملة العازلة CFTR مع 1 M كلوريد الصوديوم.
  7. تكرار الطرد المركزي من الكسر غشاء معلق (100،000 س ز، 4 درجات مئوية، 1 ساعة) وتجاهل طاف.
  8. resuspend وmicrosomes مكعبات فيالحد الأدنى من حجم المخزن المؤقت CFTR (الحجم النهائي 5-15 مل، البروتين الكلي الميكروسومي 70-200 ملغ). ويمكن استخدام فحص برادفورد لتحديد التركيز الكلي للبروتينات الميكروسومي 25. بالإضافة ينبغي قياس الطيف الانبعاثات مضان من الأغشية (الإثارة = 485 نانومتر، وانبعاث = 500-600 نانومتر)، وينبغي أن يكون متميزا GFP مضان الذروة (أقصى في 512 نانومتر). CFTR يمكن الكشف تحديدا على هلام SDS-PAGE، الممسوحة ضوئيا في ظل ظروف مضان GFP (الشكل 1).
  9. وmicrosomes معلق من قبل تغرق في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، أو الاستمرار في الخطوة 3 تجميد فلاش.

3. الانحلالية من Microsomes

  1. إذا جمدت، تذويب microsomes فورا قبل الاستخدام في حمام مائي تعيين إلى 10 درجة مئوية.
  2. لإذابة الأغشية، وتمييع microsomes مع حجم مساو من المخزن المؤقت الانحلالية ذات الصلة (الخطوة 1.3) لإعطاء تركيز المنظفات النهائية2٪ (ث / ت) وبروتين الميكروسومي تركيز 5 ملغ / مل. احتضان هذا الخليط لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية مع الإثارة (أنبوب المدورة). الاحتفاظ 200 ميكرولتر لتحليلها.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخليط (100،000 x ج، 4 ° C، 45 دقيقة). إزالة طاف تحتوي على بروتينات الغشاء solubilized، تمريرها من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون وتخزينها على الجليد. قياس مضان من طاف (كما في الخطوة 2.8).
  4. resuspend وجزء غير قابلة للذوبان في 1٪ (ث / ت) حل SDS إلى حجم مساو إلى جزء قابل للذوبان. قياس مضان في هذا الكسر والاحتفاظ قسامة من 50 ميكرولتر لتحليل SDS-PAGE.

4. تنقية النيكل وتقارب من CFTR

  1. أعمدة الرابط اثنين من 5 مل النيكل sepharose و في السلسلة. تغسل مع 2 مجلدات العمود (CV) 20٪ (V / V) الايثانول، تليها 2 CV [ده 2 O، ثم يغسل العمود مع 2 CV العازلة الانحلالية (الخطوة 1،4-1،5)، تحتوي على 1 M إيميدازول. أكرر مع 2 السيرة الذاتية لsolubilizatأيون العازلة تفتقر إيميدازول.
  2. إضافة إيميدازول إلى تركيز النهائي من 5 ملم إلى المواد solubilized (الخطوة 2.8) ويدويا تحميل المواد على عمود أو في حلقة العينة في حالة استخدام جهاز الفصل اللوني السائل الآلي.
  3. تحميل المواد solubilized على العمود بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة، ويغسل مع 2 من السيرة الذاتية العازلة تفتقر إيميدازول بمعدل تدفق نفسه لإزالة المواد غير منضم. جمع الكسور في 50 مل أنابيب فالكون.
  4. لغسل الأولى، استخدم 3 السيرة الذاتية العازلة تنقية مع 40 ملي إيميدازول بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة. جمع 2 مل الكسور.
  5. لغسل الثاني، استخدام 3 السيرة الذاتية العازلة تنقية مع 100 ملي إيميدازول. جمع 2 مل الكسور.
  6. أزل CFTR من العمود HisTrap مع 3 السيرة الذاتية العازلة تنقية مع 400 ملي إيميدازول. جمع 2 مل الكسور.
  7. رصد مضان في كسور مزال (الخطوة 2.8).
  8. الاحتفاظ مأخوذة من الكسور الذروة لتحليل SDS-PAGE. تجميد فلاش المتبقية الذروة وعينات raction وتخزينها في -80 درجة مئوية، أو انتقل إلى الخطوة تنقية المقبل.

5. جل تخلل اللوني (GPC) تنقية CFTR

  1. تتوازن العمود (6 Superose 10/300 GL) مع 1.2 CV [ده 2 O تليها 1.2 CV GPC العازلة.
  2. خلال الخطوة 5.1، والتركيز على متولى تقارب الكسور تنقيته وفقا لأعلى GFP مضان باستخدام 100،000 MWCO تصفية الطرد المركزي في 4 درجات مئوية. إذا تنقية في DDM، وتجنب التركيز العينة أعلاه تركيز البروتين من 0.3 ملغ / مل من البروتين وهذا سوف يسبب خسارة كبيرة العينة. إزالة retentate من المكثف والطرد المركزي في العاشر 100،000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الجزيئات الكبيرة.
  3. حقن هذه العينة على العمود وأزل مع التدرج isocratic 1.2 CV GPC العازلة. جمع 0.5 مل الكسور.
  4. قياس GFP مضان كما في القسم 2.8 لتحديد تلك الكسور التي تحتوي على CFTR. الاحتفاظ حجم صغير (على سبيل المثال <م /> 50 ميكرولتر) من كل لتحليلها من قبل SDS-PAGE.
  5. تجميد كسور في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

6. إعادة إعماره من CFTR

  1. إضافة الدهون (الخطوة 1.8) إلى CFTR المنقى في الدهون إلى البروتين نسبة 100:1 (ث / ث)، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تعيين بالمثل حتى ضبط الدهون فقط، استبدال البروتين النقي مع نفس الحجم من العازلة المؤتمر الشعبي العام.
  2. إزالة المنظفات من خليط من البروتين / الدهون باستخدام الخرز مكثف مسعور. تغسل حبات مكثف في 5 CV [ده 2 O، 5 CV 70٪ (V / V) الايثانول، 5 CV [ده 2 O، و 5 CV GPC العازلة التي تفتقر إلى المنظفات. إضافة 200 ملغ من الخرز مكثف غسلها لكل مل من البروتين النقي واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل مع الإثارة لطيف.
  3. جمع عينة من إعادة حبات مكثف في أنبوب جديد باستخدام رقيقة العضوية غيض ماصة.

7. قياس أتباز آخر

  1. تحديد معدل الأموال وتمويل الإرهابالنشاط أتباز R-محددة باستخدام شيفليت مقايسة تعديل 26،27 في شكل لوحة 96 جيدا. مع فوسفات الصوديوم محلول المخزون (0.65 ملم) 0-20 نانومول إعداد الفوسفات في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر من المعايير. استخدام 1:1 خليط من العازلة CFTR وعازلة أتباز لتمييع الأسهم الفوسفات.
  2. احتضان كل من CFTR المعاد والجسيمات الشحمية فارغة مع 1:100 (ت / ت) مثبطات أتباز (الخطوة 1.9) على الجليد لمدة 10 دقيقة. استخدام لا يقل عن 5 ميكروغرام من CFTR المجدد.
  3. إضافة ATP (الخطوة 1.9) إلى تركيز النهائي من 2 ملم واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وقف رد الفعل من خلال إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) SDS (الخطوة 1.9) إلى كل بئر (بما في ذلك المعايير).
  4. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة A (الخطوة 1.10)، واحتضان لمدة 10 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر العازلة B (1.10) إلى كل بئر وقياس الامتصاصية في طول موجة من 800 نانومتر في لوحة متوافق 96 جيدا للأشعة فوق البنفسجية / فيس معمل.
  5. تحويل الامتصاصية في 800 نانومتر إلى مبلغ من الفوسفات باستخدام المحررةمعايير الفوسفات. حساب معدل ATP التحلل بعد طرح إشارة الخلفية (الآبار الحويصلية فقط).
  6. لCFTR غير المعاد المتابعة نفس البروتوكول باستخدام العازلة CFTR للقراءات الخلفية.

النتائج

بروتوكول الموصوفة أعلاه هو وسيلة فعالة لعزل microsomes التخصيب CFTR، مع الانتعاش الكامل تقريبا CFTR خلال الكسر الخلية وإعداد microsomes الخام (الشكل 1). ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب الكسر الخلايا الأخرى على نحو فعال. لقد استخدمت خلية الفرنسية الضغط، وأجهزة high-pressure/cavitation الأخرى (كما في تركيبة مع التأثير ضد هدف روبي) مع كفاءة متساوية. لراحة والتكلفة الأولية المنخفضة من المعدات، نجد طريقة حبة الضرب أفضل.

استخدام غاز البترول المسال إلى ذوبان وتنقية البروتين CFTR أسفرت عن 80 ميكروغرام / لتر في الثقافة> 90٪ النقاء (الشكل 2). كانت عالية الغلة بسبب الانحلالية كفاءة CFTR بواسطة غاز البترول المسال (قارن الشكل 2B، ممرات 2 و 4). بالإضافة إلى ذلك، أدت كفاءة وضيق ملزمة لعمود في فقدان الحد الادنى من CFTR في جزء غير منضم وعدم وجود CFTR في الكسور غسل (الشكل 2، الممرات 3، 5، و6). كان البروتين مزال نقاء> 90٪، حسب تقدير Coomassie الملون والمواد الهلامية SDS-PAGE واستخدام قياس كثافة من CFTR والعصابات الملوثة. هلام اللوني تخلل (المؤتمر الشعبي العام) فصل CFTR-تنقية غاز البترول المسال من الملوثات منخفضة الوزن الجزيئي (الشكل 4، اللوحة السفلى).

بروتوكول لتنقية CFTR باستخدام DDM يعطي نقاء حوالي 60٪ والعائد من ما يقرب من 50 ميكروغرام / لتر (الشكل 3). وأظهرت الإلكترون المجهري (EM) الكسور ملطخة سلبا من المؤتمر الشعبي العام يبلغ حجمه حوالي 10 مل (الشكل 4) أن CFTR DDM تنقيته-يحتوي على مجاميع من 20-30 نانومتر قطر فضلا عن جسيمات أصغر من 10 نانومتر قطرها (لا تظهر البيانات). فمن الممكن أن المجاميع الصغيرة يمكن ربط عكسية وفصل كما الفائق مع 1 MDA وقف انتاج المواد الانشطارية تصفية فشلت في إزالة الركام EM-كشفها. لم مواد تنقية غاز البترول المسال لا كثف لشبكة-تفريغها توهج، وبالتالي تم دراستها من قبل البرد EM الكسور غير ملوثين. وأظهرت هذهيبلغ عدد سكانها الجسيمات متجانسة جدا من حجم صغير نسبيا (6-8 نانومتر قطر، لا تظهر البيانات).

أخيرا، تم قياس النشاط أتباز من البروتينات تنقيته (الشكل 5). كعضو في الأسرة البروتين ABC، CFTR اثنين من المجالات ملزمة النوكليوتيدات (NBDs) قادرة على الربط و / أو hydrolyzing ATP. وتشير البيانات إلى أن البروتين النقي لم يكن قادرا على يتحلل ATP في دولة LPG solubilized وأظهرت ضعف النشاط أتباز بحضور DDM (الشكل 5 والحانات شاغرة). بعد إضافة الدهون، وإزالة المنظفات، كان النشاط أتباز 4 أضعاف للعينات التي تم تنقيته في DDM (13 نانومول ATP / دقيقة / ملغم بروتين). إضافة الدهون وإزالة غاز البترول المسال النشاط استعادة بالمثل لCFTR التي تم عزلها باستخدام غاز البترول المسال، ولكن مع انخفاض سعر النهائي (1.5 نانومول ATP / دقيقة / ملغم بروتين) من المادة DDM تنقيته والمعاد.

figure-results-2837
الشكل 1. رصد مستويات CFTR الدجاج في المحللة الخلية (CL)، supernatants (S) والكريات (P) خلال مختلف الخطوات الطرد المركزي المستخدمة لعزل صغرور والغسيل. كانت تصور المواد الهلامية SDS-PAGE باستخدام مضان في جل من GFP العلامة. طاف بعد الكسر الخلية والطرد المركزي في 14،000 XG يحتوي تقريبا كل CFTR (بما في ذلك المنتجات تدهور). تنبيذ فائق في الرواسب 200،000 x ج جميع بالطول CFTR ترك بعض شظايا في طاف. تنبيذ فائق في 100،000 x ج لغسلها الملح microsomes الكريات ما يقرب من جميع CFTR مع إزالة بعض أجزاء أخرى.

figure-results-3614
وقد تم تحليل الشكل 2. تنقية CFTR الدجاج في غاز البترول المسال من قبل يجمد اللوني المعادن أيون تقارب. الكسور بواسطة SDS-PAGE تليها تلطيخ Coomassie (اللوحة العليا) والكشف عن مضان من العلامة GFP (اللوحة السفلى). المسارات: (1) Microsomes. (2) microsomes-solubilized LPG. (3) مواد غير منضم. (4) المواد غير القابلة للذوبان. (5) & (6) 40 و 100 ملي إيميدازول يغسل. (7) مزال المواد مع 400 ملي إيميدازول.

figure-results-4281
وقد تم تحليل الشكل 3. تنقية CFTR الدجاج في DDM بواسطة يجمد اللوني المعادن أيون تقارب. الكسور بواسطة SDS-PAGE تليها Coomassie تلطيخ. يظهر لوحة اليد اليسرى الكسور قبل شطف. وتظهر العديد من الكسور شطف متتالية في لوحة اليد اليمنى مع CFTR فيdicated بواسطة السهم. يتم إثراء الكسور في وقت لاحق في 40 كيلو دالتون الملوثات، والتي تم تحديدها من قبل مطياف الكتلة كما البروتين الريباسي L3.

figure-results-4930
وكان الرقم 4. تنقية CFTR الدجاج هلام تخلل اللوني مركزة. CFTR تنقيته بواسطة ني تقارب اللوني وتطبيقها على عمود المؤتمر الشعبي العام. الملف الشخصى للشطف CFTR (اللوحة العليا) في تنقية العازلة التي تحتوي على غاز البترول المسال-14 (خط الصلبة) أو DDM (خط متقطع) يتم مضافين. كشفت SDS-PAGE (اللوحة السفلى) أن CFTR مزال ما بين 8 و 11 مل.

figure-results-5530
الرقم 5. activit أتبازكان يعاير ذ تنقية الكسور CFTR الدجاج. البروتين المنقى في DDM أو غاز البترول المسال باستخدام مقايسة تعديل شيفليت 26 في وجود مزيج من مثبطات أتباز للقضاء على أي نشاط أتباز الخلفية من نوع V-ATPases (الحانات شاغرة F، P-و ). كما تم قياس معدل ATP التحلل بعد إزالة المنظفات وإضافة الدهون (تملأ القضبان). يظهر المؤامرة الانحراف المتوسط ​​والمعياري (ن = 3). الاختلافات بين القيم المتوسطة للنشاط أتباز في حضور وغياب الدهون، والفرق بين النشاط في DDM وغاز البترول المسال هي كبيرة ع <0.05.

Discussion

وصفناها سابقا وسيلة لoverexpression من CFTR الفئران 14. منذ نشر هذا البروتوكول، أبدينا وتنقيته عدة orthologs مختلفة من CFTR باستخدام نفس النظام. جميع orthologs اختبار تنقيته حتى الآن بشكل جيد في المنظفات غاز البترول المسال، في حين أظهرت تنقية DDM مزيد من التباين عبر orthologs مختلفة (لا تظهر البيانات). يوضح هذه المرونة قوة النهج الخميرة: من الممكن أن يحجب العديد من بنيات مع سرعة النسبية في النظام لاختيار واحد لغرض معين.

غسل microsomes الخميرة مع العازلة التي تحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم قبل الإذابة مع نتائج DDM في إعداد صغرور أنظف ويقلل من الملوثات في مراحل لاحقة. هذه الخطوة غير ضرورية في البروتوكول غاز البترول المسال كما العينة CFTR النهائي هو> 90٪ نقية دون غسل صغرور. وعلاوة على ذلك، وتنقية في DDM يتطلب عدة تعديلات على مخازن للذوبان وتنقية الثانية، وهي إضافة الجلسرين الزائدة والملح. معا، وهذه الإضافات زيادة كبيرة الربط من البروتين DDM solubilized إلى العمود.

منهجية تنقية DDM لديه مجال للتحسين، لا سيما إزالة الملوثات الرئيسية 40 كيلو دالتون أن يحكم عليها مطياف الكتلة هو، وذلك بسبب الوحيدات الريباسي L3 الخميرة، والذي يظهر أن يكون هناك تقارب المتأصلة للالراتنج النيكل. ليس هناك تسلسل واضح في polyHis البروتين L3، ولكن فحص هيكل 3D به عند منضمة إلى الريبوسوم (PDB = 1FFK) يدل على أن L3 الوحيدات مطوية لديه كتلة polyHis المحتملة. أن هذه الفرقة هي أقل إثارة للمشاكل في مواد تنقية غاز البترول المسال قد يكون راجعا إلى أقسى المنظفات غاز البترول المسال.

على الرغم من أن تنقية في DDM يبدو أن أفقر من أن في غاز البترول المسال والمنظفات أكثر اعتدالا مثل DDM قد يكون أكثر توافقا مع التحليلات الفنية والهيكلية وبالفعل تم استخدامها في العديد من البلورات بالأشعة السينيةدراسات ographic من البروتينات الغشاء 15-21. وعلاوة على ذلك، أشارت نتائجنا إلى أن استخدام غاز البترول المسال يؤدي إلى فقدان وظائف في أتباز CFTR النسبية لتنقية في DDM. وبالتالي فإننا نوصي بروتوكول تنقية القائمة على غاز البترول المسال لتوليد CFTR حيث نقاء أمر بالغ الأهمية، على سبيل المثال في تطبيقات مثل توصيف التعديلات بعد متعدية، أو في توليد الأجسام المضادة، وسيتم اختيار البروتوكول القائم على غاز البترول المسال . من ناحية أخرى في التطبيقات حيث النشاط والدولة الأم بالكامل من البروتين ضروري، فإننا نقترح البروتوكول القائم على DDM كخيار أفضل.

على أن تبرم، يصف هذا البروتوكول طريقة استنساخه لعزل CFTR في المنظفات ثنائي الشحنة وهو LPG-14 أو المنظفات غير الأيونية DDM. على هذا النحو فإنه يشير إلى مجموعة أكبر من الظروف تنقية للCFTR من سبق وذكرت 10-13. بالإضافة مليغرام كميات CFTR تنقيته يمكن أن يكونتم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات عند دمجها مع نظام نمو الخميرة ارتفاع حجم مثل تخمير 20 L وقدرة عالية نظام حصاد الخلايا مثل 6 L سرعة منخفضة الطرد المركزي الدوار. وCFTR حصلت لديه علامة GFP شطورة الذي يسمح رصد سهل من البروتين في مختلف المقايسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية.

كاشف الموضحة في هذه المخطوطة (الدجاج المحتوية على البلازميد CFTR أو خلايا الخميرة المجمدة) ويمكن الحصول عليها من خلال مؤسسة التليف الكيسي (الولايات المتحدة الأمريكية).

Disclosures

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية ولا المصالح المتضاربة المتنافسة الأخرى فيما يتعلق بهذا العمل.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة التليف الكيسي في الولايات المتحدة (CFF) من خلال اتحاد CFTR 3D هيكل. وقد تم تمويل TR قبل studentship المملكة المتحدة CF الثقة، وNC قبل studentship المملكة المتحدة BBSRC. نحن نعترف زملائنا في هيكل اتحاد CFF CFTR 3D لمساعدتهم وتقديم المشورة وللتصميم الدجاج تسلسل CFTR وتنقية به الأمثل كودون.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filter SartoriusFC121
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)VivaspinVS0641
2 ml microfuge tubesSarstedt72.695
40Ti rotorBeckman Coulter337901
50 ml sterile Falcon tubesSarstedt62.547.254
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)Sigma-AldrichA26209
Liquid chromatography systemGE Healthcare28-4062-64
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)Sigma-AldrichA8456
Glass bead-beating cell disrupterBioSpec1107900
Benchtop centrifuge HERMLEZ300
Benchtop centrifuge Eppendorf5417R
Benchtop microfuge Fisher13-100-511
Benzamidine hydrochlorideSigma-Aldrich434760
Hydrophobic Beads SM-2 AdsorbentBioRad152-3920
Bromophenol blueSigma-Aldrich114391
Centrifuge tubesBeckman Coulter357000
Gel imaging systemBioRad170-808
CholesterolSigma-AldrichC8667
Chymostatin Sigma-AldrichC7268
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
E. coli total lipid extractAvanti lipids100500
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)Sigma-AldrichE3132
Glass beads, acid washedSigmaG8772
GlycerolFisher65017
HisTrap HP columns (5 ml)GE Healthcare17-5247-05
Rapid Coomassie StainNovexinISB1L
Centrifuge JA-17 rotorBeckman Coulter369691
LeupeptinMerck108975
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)Avanti lipids858120
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Gel tank SDS-PAGE systemBioRad165-8006
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM)AffymetrixD310S
NaClSigma-AldrichS6191
NaN3Sigma-AldrichS2002
NH4ClSigma-AldrichA9434
OligomycinSigma-Aldrich75351
UltracentrifugeBeckman Coulter392050
Prestained protein standardsFermentasSM1811
Desalting columns (Sephadex G-25)GE Healthcare17-0851-01
Pepstatin ASigma-AldrichP4265
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626
SCH28080Sigma-AldrichS4443
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL37771
Sodium thiocyanate (NaSCN)Sigma-Aldrich251410
Gel filtration 10/300 GL columnGE Healthcare17-5172-01
Tris-baseFormediumTRIS01
Ultracentrifuge tubesBeckman Coulter355618
Vortex mixerStar LabsN2400-0001
Ultrasonic water bathUltrawaveF0002202
Multimode plate readerBioTekBTH1MF

References

  1. Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
  2. Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
  3. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373, 1891-1904 (2009).
  4. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
  5. Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
  6. Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
  7. Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
  8. Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
  9. Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
  10. Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
  11. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
  12. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
  13. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
  14. O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. , (2012).
  15. Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
  16. Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
  17. Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
  18. Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
  19. Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
  20. Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
  21. Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
  22. Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
  23. Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
  24. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
  27. Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

87 CFTR ABCC7

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved