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Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen.
Defekte in der Mukoviszidose-Transmembran Regulator (CFTR)-Protein führen zystischer Fibrose (CF), eine autosomal-rezessive Erkrankung, die derzeit begrenzt die durchschnittliche Lebenserwartung der Erkrankten bis <40 Jahre alt. Die Entwicklung neuer Wirkstoffmoleküle, die Aktivität von CFTR wiederherzustellen, ist ein wichtiges Ziel in der Behandlung CF, und die Isolation von funktionell aktiven CFTR ist ein sinnvoller Schritt zur Erreichung dieses Ziels.
Wir beschreiben zwei Verfahren zur Reinigung von CFTR aus einer eukaryotischen heterologen Expressionssystem, S. cerevisiae. Wie prokaryotischen Systemen, S. cerevisiae kann schnell im Labor mit geringen Kosten angebaut werden, kann aber auch Verkehrs-und posttranslational große Membranproteine modifizieren. Die Auswahl von Detergentien zur Solubilisierung und Reinigung ist ein kritischer Schritt bei der Reinigung von jeder Membranprotein. Nachdem die Löslichkeit von CFTR in mehreren Detergenzien gescreent, haben wir zwei Co ausgewähltntrasting Detergenzien zur Verwendung bei der Reinigung, die die endgültige CFTR Vorbereitung auf die später geplanten Experimenten zugeschnitten werden können.
Bei diesem Verfahren stellen wir Vergleich der Reinigung von CFTR in Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) und 1-Tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerin) (LPG-14). Protein in DDM mit dieser Methode gereinigt zeigt ATPase-Aktivität in funktionellen Tests. Protein in LPG-14 gereinigt zeigt hoher Reinheit und Ausbeute, kann verwendet werden, um post-translationale Modifikationen zu untersuchen, und für strukturelle Methoden wie Kleinwinkelröntgenstreuung und Elektronenmikroskopie eingesetzt werden. Aber es zeigt deutlich niedriger ATPase-Aktivität.
Cystische Fibrose (CF) ist die häufigste genetische Erkrankung in Europa und Nordamerika mit einer Inzidenz von etwa 1 zu 2.500 Lebendgeburten. CF tritt bei Mutationen in der Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR)-Protein zu einem Verlust der Funktion an der Plasmamembran von Epithelzellen 1. Die schwerwiegendste Folge dieses Mangels ist irreversible Lungenschäden, die die Lebenserwartung der Betroffenen bis <40 Jahre 2,3 verkürzt.
CFTR ist ein ATP-binding cassette (ABC)-Transporter, die sich entwickelt hat, um ein Ionenkanal 1,4 geworden. Trotz seiner ziemlich veränderte Funktion in der Plasmamembran von Zellen, ist es noch immer eine signifikante Sequenzhomologie mit anderen ABC-Transportern. Interessanter, die Sonderteile von CFTR (dh seine regulatorischen Region und ihre N-und C-Termini) teilen sich keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit anderen Metazoen ABC-Transporter, daher gibt es keine Hinweise auf thE Ursprünge dieser Sequenzen in CFTR. Auf der Basis seiner Primärstruktur wird CFTR als C-Familienmitglied der ABC-Transporter-Familie eingestuft, aber es gibt keine starken Beweise für eine Rest funktionellen Verknüpfung zu dieser Unterfamilie. Es wurden für 5-7 CFTR einige Berichte von Glutathion Transportaktivität, das wäre im Einklang mit den Rollen der anderen C-Familienmitglieder 8,9, obwohl auch andere Berichte deuten darauf hin, dass reduzierte Glutathion kann das CFTR-ATPase-Aktivität zu hemmen, statt, die die Substrat-induzierte Stimulation, die der ABC-Transporter 10 charakterisieren. Messung der Ionenleitfähigkeit ist empfindlich genug, damit die Kanalaktivität einzelner CFTR-Moleküle zu unter 1 und CFTR-Kanals Eigenschaften wurden als Funktion der Zeit, der Temperatur, der ATP-Konzentration, Membranpotential und Phosphorylierung als auch in der überwacht Vorhandensein einer Vielzahl von niedermolekularen Inhibitoren, Potentiatoren und Modifikatoren. DieseStudien haben auch wesentlich zu unserem Wissen, wie ABC-Transporter funktionieren aufgenommen. Dennoch Expression von CFTR in signifikanten Mengen und ihre anschließende Reinigung hat sich als besonders anspruchsvoll und Erfolg auf einige wenige Labors 10-13 beschränkt zu sein.
Die Notwendigkeit, wirksamere Medikamente zu entwickeln drängt, doch dieser Prozess durch den Mangel an CFTR gereinigt für das Screening kleiner Moleküle behindert. Die Lösung des CFTR-Expression und Reinigung Problem wäre Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening auf eine Korrektur des primären Defekt in CF ausgerichtet und ermöglichen würden zudem eine Route für hochauflösende Strukturuntersuchungen zu Rational Drug Design zu informieren. Selbst relativ grundlegenden biochemischen Eigenschaften des Proteins, wie seine funktionellen oligomeren Zustand, interagierende Proteine und ATPase-Aktivität bleiben schlecht charakterisiert. Wir haben zuvor ein Protokoll für die großtechnische Expression von GFP-und His-markierten murinen CFTR berichtetin S. cerevisiae 14 und nun beschriebenen Protokolle für die Reinigung von CFTR. Wir haben diese Methoden verwendet, um fünf Orthologe von CFTR und Darstellung von Daten für die Reinigung von Hühner CFTR als Beispiel zu reinigen. Die Auswahl von Detergentien zur Solubilisierung und Reinigung ist ein kritischer Schritt bei der Reinigung von jeder Membranprotein. Nachdem die Löslichkeit von CFTR in mehreren Detergenzien gescreent, haben wir zwei kontras Detergenzien zur Verwendung in der Reinigung ausgewählt. Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) ein nicht-ionisches Detergens wurde ausgiebig sowohl für strukturelle und funktionelle Studien von Membranproteinen 15-21 verwendet. Das ionische Detergens 1-Tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerin) (LPG-14) ist bei der Solubilisierung von CFTR hocheffiziente und vorher bei der Reinigung von funktionellen Membranproteine 10 verwendet wurde, 22,23, einschließlich Reinigung des CFTR von S. 24 cerevisiae.
1. Herstellung von Puffern
2. Isolierung von Hefe-Mikrosomen
3. Solubilisierung von Mikrosomen
4. Nickel-Affinitätsreinigung von CFTR
5. Gelpermeationschromatographie (GPC) Reinigung des CFTR
6. Rekonstitution von CFTR
7. Messung der ATPase-Aktivität
Das oben beschriebene Protokoll ist ein effizientes Mittel, um CFTR angereicherte Mikros fast vollständige Wiederherstellung der CFTR während des Zellbruch und Herstellung der Roh-Mikrosomen (Fig. 1) zu isolieren. Andere Zellbruchverfahren können auch effektiv verwendet werden. Wir haben eine Druckzelle Französisch und andere high-pressure/cavitation Geräte (auch in Kombination mit Auftreffen auf einem Rubin Ziel) mit gleicher Effizienz eingesetzt. Für Komfort und niedrigen Anschaffungskosten der Geräte, finden wir die Wulst-Verfahren die besten Schläge.
Mit LPG um sie zu lösen und zu reinigen CFTR ergab 80 ug Protein / L Kultur bei> 90% Reinheit (Abbildung 2). Die hohe Ausbeute war durch effiziente Solubilisierung von CFTR von LPG (vgl. Abb. 2b, Spuren 2 und 4). Außerdem effizient und feste Bindung an die Säule führte zu einem minimalen Verlust von CFTR in der ungebundenen Fraktion und der Abwesenheit von CFTR in den Waschfraktionen (Fig. 2, Bahnen 3, 5, und6). Das eluierte Protein besaß eine Reinheit von> 90%, durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gelen abgeschätzt und mit Densitometrie des CFTR-und Schadstoff Bands. Gelpermeationschromatographie (GPC) getrennt LPG-CFTR gereinigt von Verunreinigungen Gewicht niedermolekularen (Abbildung 4, unteres Bild).
Das Protokoll für die Reinigung unter Verwendung von CFTR DDM gibt Reinheit von etwa 60% und die Ausbeute von etwa 50 ug / l (Fig. 3). Elektronenmikroskopie (EM) von negativ gefärbten Fraktionen, die von der GPC-Elution bei 10 ml (Fig. 4) zeigte, dass DDM-gereinigt CFTR enthält Aggregate von 20-30 nm Durchmesser und kleinere Teilchen von 10 nm Durchmesser (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass die kleinen Aggregate reversibel zu verknüpfen und distanzieren wie Ultrafiltration mit einer 1 MDa cut-off Filter war nicht in der EM-nachweisbar Aggregate zu entfernen. LPG-gereinigte Material nicht zu einer Schein-Netz entladen adsorbieren, daher wurde durch Kryo-EM der ungefärbten Fraktionen untersucht. Dies zeigte,eine sehr homogene Kornpopulation einer relativ geringen Größe (6-8 nm Durchmesser, Daten nicht gezeigt).
Schließlich wurde die ATPase-Aktivität der gereinigten Proteine (Abbildung 5) gemessen. Als Mitglied der ABC-Protein-Familie, hat CFTR zwei Nukleotid-Bindungsdomänen (NBDs), die zur Bindung und / oder Hydrolyse von ATP. Die Daten zeigen, daß das gereinigte Protein war nicht in der Lage, ATP in der LPG-solubilisierten Zustand hydrolysieren und zeigte schwache ATPase-Aktivität in Gegenwart von DDM (Abbildung 5, ungefüllte Balken). Nach der Zugabe von Lipiden und Entfernen des Detergens wurde die ATPase-Aktivität 4-fach höher für Proben, die in DDM (13 nmol ATP / min / mg Protein) gereinigt worden war. Die Zugabe von Lipiden und Entfernen von LPG ähnlich wiederhergestellt Aktivität CFTR isoliert worden waren, die mit LPG, jedoch mit einer abschließenden Untersatz (1,5 nmol ATP / min / mg Protein) als die DDM-gereinigt und wiederhergestellten Materials.
1. Überwachungsebenen Huhn CFTR im Zelllysat (CL), die Überstände (S) und Pellets (P) während der verschiedenen Schritte der Zentrifugation für Mikros Isolierung und Waschen verwendet. SDS-PAGE Gele wurden unter Verwendung des in-Gel-Fluoreszenz des GFP visualisiert -Tag. Der Überstand nach dem Aufbrechen der Zellen und Zentrifugation bei 14000 × g enthält praktisch alle CFTR (einschließlich Abbauprodukte). Ultrazentrifugation bei 200.000 xg Sedimente alle in voller Länge CFTR verlassen einige Fragmente im Überstand. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g salz gewaschen Mikros Pellets fast alle CFTR mit dem Entfernen einiger weiterer Fragmente.
2. Reinigung von Hühner CFTR in LPG durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung (oberes Feld) und Fluoreszenz-Detektion des GFP-Tag (untere Tafel) untersucht. Tracks: (1) Mikrosomen. (2) LPG-Mikrosomen gelöst. (3) Nicht konsolidiert Material. (4) Das unlösliche Material. (5) und (6) 40 bis 100 mM Imidazol-Waschanlagen. (7) Material eluiert mit 400 mM Imidazol.
3. Reinigung von Hühner CFTR in DDM durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung analysiert. Die Linke Tafel zeigt Fraktionen vor der Elution. Mehrere aufeinanderfolgende Elution Fraktionen werden in der rechten Panel mit CFTR in gezeigtdurch den Pfeil dicated. Später Fraktionen werden in einem 40 kDa Verunreinigung, die durch Massenspektrometrie als ribosomale Protein L3 identifiziert wurde bereichert.
4. Reinigung von Hühner CFTR durch Gelpermeationschromatographie. CFTR durch Ni-Affinitätschromatographie gereinigt wurde, eingeengt und auf einem GPC-Säule aufgetragen. Das Elutionsprofil für CFTR (oben) in Puffer gereinigt enthalten LPG-14 (durchgezogene Linie) oder DDM (gestrichelte Linie) überlagert werden. SDS-PAGE (unten) ergab, dass CFTR zwischen 8 und 11 ml eluiert.
Abbildung 5. ATPase activity gereinigtes Hühner CFTR Fraktionen. Protein in DDM oder LPG gereinigt wurde unter Verwendung einer modifizierten Chifflet Assay 26 in Gegenwart eines Cocktails von ATPase-Inhibitoren, jede Hintergrund-ATPase-Aktivität von F-, P-und V-Typ-ATPasen (ungefüllte Balken zu entfernen getestet ). Die Rate der ATP-Hydrolyse wurde auch nach Entfernung des Detergens und Lipid-Zugabe (gefüllte Balken) gemessen. Das Diagramm zeigt den Mittelwert und Standardabweichung (n = 3). Unterschiede zwischen den Mittelwerten für die ATPase-Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Lipid und Differenz-Aktivität in DDM und LPG signifikant für p <0,05.
Wir haben zuvor für die Überexpression des murinen CFTR 14 beschriebenen Verfahrens. Seit der Veröffentlichung des Protokolls, haben wir verschiedene Orthologen von CFTR Ausdruck gebracht haben und gereinigt mit dem gleichen System. Orthologe alle bisher getesteten und in dem Flüssiggas-Waschmittel gereinigt, während die DDM-Reinigung zeigte mehr Variation in verschiedenen Orthologe (Daten nicht gezeigt). Diese Flexibilität zeigt die Stärke des Hefe-Ansatz: Es ist möglich, viele Konstrukte relativ rasch, um ein für einen bestimmten Zweck zu wählen screenen.
Waschen der Hefe-Mikrosomen mit Puffer, enthaltend 1 M NaCl vor der DDM-Ergebnisse in einer Reinigungsmikros Herstellung Solubilisierung und reduziert Verunreinigungen in späteren Phasen. Dieser Schritt ist nicht notwendig in der LPG-Protokoll als die endgültige CFTR Probe> 90% rein, ohne die Mikros waschen. Außerdem, Reinigung im DDM erfordert mehrere Änderungen der Puffer zur Solubilisierung einnd Reinigung, nämlich die zusätzliche Zugabe von Glycerin und Salz. Zusammen stellen diese Zusätze deutlich die Bindung des DDM-solubilisierten Protein an der Säule erhöht.
Das DDM Reinigungsmethode hat Raum für Verbesserungen, insbesondere die Entnahme eines 40 kDa großen Verunreinigung, die durch Massenspektrometrie beurteilt, ist aufgrund der Hefe ribosomalen Untereinheit L3, die eine inhärente Affinität für Nickel Harz zu haben scheint. Es gibt keinen offensichtlichen polyHis-Sequenz in der L3-Protein, aber Prüfung der 3D-Struktur, wenn das Ribosom gebunden (PDB = 1FFK) zeigt, dass der gefaltete L3-Untereinheit hat ein Potential polyHis Cluster. Dass diese Band ist in LPG-gereinigte Material weniger problematisch kann aufgrund der härteren LPG Reinigungsmittel sein.
Obwohl die Reinigung in DDM scheint schlechter als die in der LPG zu sein, kann milder Detergenzien wie DDM mehr mit funktionellen und strukturellen Analysen kompatibel sein und haben bereits in mehreren Röntgen crystall verwendetographic Studien von Membranproteinen 15-21. Ferner bezeichnet unsere Ergebnisse, dass die Verwendung von LPG führt zum Verlust der ATPase-Funktion in Bezug auf die Reinigung CFTR in DDM. Daher würden wir die LPG-basierte Reinigungsprotokoll für die Erzeugung von CFTR wobei die Reinheit entscheidend empfehlen, beispielsweise in Anwendungen wie der Charakterisierung von posttranslationaler Modifikationen, oder bei der Erzeugung von Antikörpern, die LPG-basiertes Protokoll gewählt werden würde . Auf der anderen Seite in Anwendungen, bei denen die Aktivität und vollständig nativen Zustand des Proteins ist wesentlich, würden wir die DDM-basiertes Protokoll als eine bessere Option vorschlagen.
Abschließend Dieses Protokoll beschreibt ein reproduzierbares Verfahren zur Isolierung von CFTR in der zwitterionischen Detergens-LPG 14 oder das nicht-ionische Detergens DDM. Als solche zeigt eine größere Palette von Reinigungsbedingungen für CFTR als zuvor berichtet worden, 10-13. Zusätzlich Milligramm-Mengen von gereinigtem CFTR kannunter Verwendung dieser Verfahren, wenn sie mit einem hohen Volumen Hefewachstum System wie einem 20 L Fermenter und einer hohen Kapazität Zellerntesystem, wie ein 6 L niedriger Geschwindigkeit Zentrifugenrotor in Verbindung erhalten. Das erhaltene CFTR einen spalt GFP-Tag, das eine einfache Überwachung des Proteins in verschiedenen biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen ermöglicht.
Die in dieser Handschrift (Huhn CFTR-haltige Plasmid oder gefrorene Hefe-Zellen) beschrieben Reagenz kann durch die Cystic Fibrosis Foundation (USA) bezogen werden.
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb noch andere widerstreitenden Interessen in Bezug auf diese Arbeit.
Diese Arbeit wurde von der US-Cystic Fibrosis Foundation (CFF) durch ihre Struktur Consortium CFTR 3D finanziert. TR wurde von einem britischen CF Treu Stipendium und NC von einer britischen BBSRC Stipendium finanziert. Wir bekennen uns zu unserer Kollegen in der CFF CFTR 3D-Struktur Konsortium für ihre Hilfe und Beratung und für die Gestaltung der Codon-optimierten Huhn CFTR-Sequenz und Reinigung Tags.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm syringe filter | Sartorius | FC121 | |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 | |
2 ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 | |
50 ml sterile Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 | |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
E. coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 | |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
Glycerol | Fisher | 65017 | |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 | |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
Leupeptin | Merck | 108975 | |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 | |
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
SCH28080 | Sigma-Aldrich | S4443 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 | |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 | |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 | |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 | |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |
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