رصد Juxtacellular وتوطين واحدة الخلايا العصبية داخل الدماغ الهياكل الفرعية القشرية للتنبيه، الجرذان-ضبط النفس رئيس

Summary

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Abstract

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Introduction

مراقبة نشاط الخلايا العصبية في حيوان في حالة تأهب تشارك بنشاط في مهمة السلوكية أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفة وتنظيم الجهاز العصبي. وقد تم تسجيل خارج الخلية من النشاط الكهربائي من وحدات الخلايا العصبية واحدة لفترة طويلة أداة الأساسية لنظم علم الأعصاب وما زال على نطاق واسع في استخدام في الوقت الحاضر. تتوفر مجموعة متنوعة من أنواع القطب وتكوينات اعتمادا على المطالب العلمية والتقنية للتجربة معينة. مزروع مزمنة ميكرودريفيس أو وغالبا ما تستخدم صفائف الكهربائي في الحيوانات تتحرك بحرية، بما في ذلك الطيور والقوارض، والرئيسيات غير البشرية ^1-4. بدلا من ذلك، وغالبا ما تستخدم الاختراقات الحادة مع المعدن أو الزجاج الميكروية عبر مياداة مجهرية الخارجي لتسجيل من الحيوانات تخدير أو تقييد الرأس. زجاج كهربائي ممص مكروى لديها ميزة أنها يمكن أن تستخدم في juxtacellular أو "خلية المرفقة" التكوين لعزل لا لبس فيهنشاط الخلايا العصبية واحدة دون مضاعفات ارتفاع اللاحق الفرز ^5. هذه الأقطاب مزيد يسمح التسجيل من الخلايا التي تم تحديدها تشريحيا أو المواقع، لأنها يمكن أن تستخدم لحقن دائع صغيرة من الصبغة أو تشريحي عصبي استشفاف، أو حتى لملء سجلت الفرد الخلية. وقد تم تطبيق هذا التكوين بنجاح في الجرذان والفئران والطيور ^6-10. وتركز تقنية وصفها حاليا على مراقبة juxtacellular والودائع صبغ خارج الخلية في حالة تأهب، الفئران ضبط النفس الرأس. لاحظ أنه على عكس خلية واحدة juxtacellular يملأ، هذه الودائع صبغ لا تقدم معلومات حول مورفولوجيا الخلايا أو إسقاطات محور عصبي ^11، لكنها تمكين التوطين التشريحي الدقيق إلى ما يقرب من 50 ميكرون، وخطيرة، ولها عائد أعلى بكثير في الحيوانات تنبيه. المعلومات المتعلقة خلية واحدة juxtacellular يملأ مع ذلك يتم توفير كاستراتيجية بديلة لوضع العلامات التشريحية.

وباختصار، فإنيتكون البروتوكول من ثلاث مراحل رئيسية. في المرحلة الأولى، وتأقلم الفئران على ضبط النفس في الجسم جورب القماش (الشكل 1) على مدى فترة من 6 أيام. في المرحلة الثانية، وهو جهاز مساند الرأس (الشكل 2) وغرفة تسجيل تزرع جراحيا مثل هذه أن الفئران يمكن الحفاظ في الطائرة التجسيمي خلال عدة جلسات تسجيل اللاحقة (الشكل 3)؛ يتيح هذا الإجراء المجرب لاستهداف مناطق معينة دون القشرية من الدماغ للدراسة الكهربية على أساس مرجعية معيارية تنسق ^12. المرحلة الثالثة تتضمن وضع الفئران في رقصة المناسبة لإجراء التجارب السلوكية والكهربية (الشكل 4)، بناء القطب من أنبوب الكوارتز الشعرية (الشكل 5)، مما يجعل التسجيلات العصبية juxtacellular أن عزل لا لبس فيه وحدة واحدة ^6-9، و بمناسبة locati التشريحيةعلى الموقع تسجيل مع شيكاغو السماء الزرقاء صبغ (أرقام 6 و 7). يتم تنفيذ التسجيلات مع الرصد السلوكي في وقت واحد. ومع ذلك، فإن التفاصيل الفنية للسلوك يعتمد على الأهداف العلمية من كل تجربة، وبالتالي فهي خارج نطاق بروتوكول واحد. بعد الانتهاء من إجراء التجارب، والتي يمكن أن تتكرر في أيام متعددة، والموت الرحيم للحيوان. يتم استخراج الدماغ ومعالجتها وفقا للتقنيات القياسية تشريحي عصبي باستخدام الحقل مشرق أو مضان المجهر.

Protocol

تم تنفيذ البروتوكولات التجريبية خارجا على إناث فئران لونغ إيفانس (250-350 ز) وفقا لرعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية المنصوص عليها اتحاديا وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو.

1. التأقلم الفئران على الجسم ضبط النفس

ملاحظة: ضع الفئران على نظام غذائي مقيدة. إطعام الفئران مرة واحدة يوميا مباشرة بعد كل دورة المعالجة اليومية للتأقلم الفئران على ضبط النفس (موضح أدناه). توفير تغذية كافية للحفاظ على الحيوانات في 80٪ من وزنه الأولي. هذا المبلغ هو ما يقرب من 6 غرامات من الأعلاف يوميا لمدة 250 غ أنثى طويل ايفانز الفئران.

1. تأقلم الفئران ليجري التعامل معها من قبل البشر. بلطف كبح جماح الفئران باليد لفترات من حوالي 5 ثانية كل 30 ثانية. القيام بذلك لمدة 15 دقيقة يوميا في 2 أيام متتالية. مراقبة الفئران يوميا لعلامات الإجهاد أثناء فترة التدريب. وتشمل علامات تكافح طاستجابة ن إلى ضبط النفس، والنطق، والأسنان الثرثارة.
2. في يوم 3 ^{الثالثة،} وضع الفئران في قطعة قماش جورب-يقيد الجسم (الشكل 1) لمدة 15 دقيقة يوميا على يومين متتاليين.
3. في يوم 5 ^{الجاري،} وضع الفئران داخل جورب، ووضع جورب داخل أنبوب جامدة على رقصة التجريبية (الشكل 4). ترك الفئران في الأنبوب لمدة 15 دقيقة يوميا في 2 أيام متتالية.
4. إطعام الفئران مباشرة بعد كل دورة تدريبية. في نهاية الدورة الأخيرة ^(ال يوم 6) منح حق الوصول غير المقيد إلى الغذاء. اختر لزرع فقط تلك الفئران التي لا تظهر عليها علامات الإجهاد المفرط في اليوم التدريب الأخير.
   ملاحظة: على الرغم من اختيار الفئران لزرع هو ذاتي، في أيدينا تم العثور على أكثر من 90٪ من الفئران أن تكون استجابة لالتعود وقادرة على الخضوع لزرع.

2. غرس غرفة تسجيل وجها لضبط النفس آلية

1. جعل إعادةسلك املؤمتر عن طريق لحام أسلاك مكشوفة الفولاذ المقاوم للصدأ لموصل دبوس. قطع الأسلاك بحيث تبقى 3-5 ملم كشفت من قبل دبوس. الأوتوكلاف السلك إشارة، جنبا إلى جنب مع جميع الأدوات الجراحية.
2. إدارة الكيتامين / زيلازين التخدير. إدارة 95 ملغم / كغم من الكيتامين مختلطة مع 5 ملغ / كغ زيلازين البريتونى. الجرعة الأولي يستمر لمدة 1½ إلى 2 ساعة. تكملة التخدير كل 30-45 دقيقة بعد ذلك، حسب الحاجة. تليين عيون الحيوان مع مرهم للعين.
3. تحقق منعكس اصبع القدم انسحاب لتحديد الطائرة من التخدير، والحفاظ على التخدير عند الضرورة.
4. وضع الفئران في إطار عقد التجسيمي بقضبان الأذن (الشكل 3A). حلق الشعر على الرأس وتطهير مكان الجرح مع بوفيدون اليود (حل 10٪). احرص على إدراج القضبان الأذن بشكل مناسب بحيث لا تضر طبلة الأذن. القضبان الأذن مع نصائح صريحة هي الأفضل.
5. إجراء شق مع مشرط يقاربالمطاف على طول خط الوسط من الجمجمة من مستوى rostro الذيلية للعيون إلى الجزء الخلفي من الأذنين. استخدام مقص لقطع وإزالة 2-3 ملم شريط من الجلد على جانبي الشق.
6. كشط بعيدا السمحاق لفضح سطح الجمجمة إلى التلال الجانبية. تغطية الجمجمة يتعرض مع طبقة رقيقة من superglue.
7. حفر حفرة صغيرة، وقطره أصغر قليلا من 0-80 مسامير، وذلك باستخدام ½ مم لدغ الحفر (انظر قسم المواد). حفر حفرة الخلفي فورا إلى حيث تجتمع خياطة bregma الحافة الجانبية، وبزاوية 30-45 درجة في الجمجمة، بحيث المسمار يمكن أن تذهب في مع الجزء العلوي الجانبي أكثر من القاع.
8. برغي في المسمار 0-80 آلة مسطحة القاع إلى الحفرة (تقريبا 3 أدوار)، في 30-45 درجة زاوية. يجب الحرص على عدم المسمار في عميق جدا لتجنب إتلاف أنسجة الدماغ الكامنة.
9. كرر هذا الإجراء لمدة 6 مسامير إضافية في تكوين معروضة (الشكل 3B). تطبيق superglue إلى قاعدة جميع المسامير.
10. وضع إبرة حقنة في تتلاعب stereotax. قياس من خياطة bregma، وإحداث تأثير في الجمجمة مع الإبرة القريب، ولكن خارج موقع حج القحف المطلوب، كعلامة مرجعية.
    ملاحظة: في هذه التظاهرة، الإحداثيات التجسيمي للعلامة هي 3 ملم الخلفي و 1 مم الجانبية للخياطة bregma.
11. بمناسبة دنت مع علامة دائمة. ملاحظة إحداثيات التجسيمي للعلامة، لأنها سوف تكون بمثابة نقطة مرجعية التجسيمي (الشكل 3B).
12. جعل حج القحف تركزت على الإحداثيات المطلوبة (3 ملم الخلفي و3 مم الجانبية لbregma في هذا المثال). ترك الأم الجافية سليمة. تغطية حج القحف مع تعديل السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (125 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES، 3.1 ملي CaCl _2، 1.3 ملي MgCl _2، ودرجة الحموضة 7.4) ¹³ (الشكل 3C).
13. قطع أنبوب 0.2 مل الطرد المركزي إلى 4-5 ملم في الطول، وقطع الغطاء. وضع أنبوب على الجمجمة ومركز على مدى حج القحف.
14. تطبيق الاسمنت الأسنان حول الجزء السفلي من الأنبوب لاغلاق القاعدة من الأنبوب إلى الجمجمة. يجب الحرص على عدم تسرب الأسمنت في حج القحف يتعرض (الشكل 3D).
15. حفر ثقب صغير آخر (حوالي ½ مم) في لوحة الجمجمة المقابل وإدراج بعناية السلك المرجعية. بناء الأسلاك إشارة عن طريق لحام دبوس التي واجهات مع مكبر للصوت تسجيل لنهاية السلك (انظر القسم المعدات). لا تتحرك السلك إشارة مرة واحدة هو في الدماغ لأن هذا قد يسبب الضرر.
16. تطبيق superglue إلى الحفرة التي تم إدراج السلك. وهذا ختم دبوس والأسلاك في مكانها مؤقتا.
17. مزيج شطري عدة هلام السيليكون (انظر قسم المواد) في أجزاء متساوية تقريبا. انتظر دقيقتين لخلط وفيلل أنبوب الطرد المركزي حوالي ⅓ الكامل مع هلام.
18. إرفاق آخر زاوية الحق المشبك (انظر قسم المواد) إلى شريط الرأس ضبط النفس. نعلق لوحة الرأس (الشكل 2A) إلى شريط القابضة (الشكل 2B) في زاوية 45 درجة الملعب بحيث الجزء السفلي من لوحة هو نحو الأنف من الحيوان. ومن المفيد لاستخدام الميل لضبط زاوية الملعب في المباراة التي من رقصة التجريبية (الشكل 4).
19. إرفاق شريط عقد على الذراع stereotax مناور بحيث شريط موازية للالقضبان الأذن. خفض شريط وصفيحة بحيث لوحة هي الخلفي للخياطة امدا والأمامية إلى الذيلية أقصى المسمار.
20. فهم الأمامي رئيس الترباس (وهو 8-32 مسمار أو برغي، راجع قسم المواد) في حوالي 45 درجة زاوية مع يد العون الذراع والمشبك، حتى أن رئيس المسمار يواجه أسفل ونحو ذيل الحيوان. خفض المسمار بحيث أنها تمس النملةerior 0-80 مسامير (الشكل 3F، G).
21. تأمين الترباس ولوحة في مكان مع الاكريليك الأسنان. تطبيق الاكريليك الأسنان في جميع أنحاء رؤساء المسمار العظام، دبوس المرجعية، وحول جوانب أنبوب الطرد المركزي. انتظر حوالي 10 دقيقة لالاكريليك الأسنان لتجف (الشكل 3H).
22. ضع طبقة من الاسمنت الأسنان حول حواف الاكريليك الأسنان، وتقوية الجلد لعملية الزرع. انتظر حتى يجف الأسمنت.
23. كزة عدة فتحات في السقف من أنبوب الطرد المركزي، ووضع غطاء على أنبوب.
24. إزالة يد العون المشبك. ثم إزالة بعناية شريط-عقد رئيس من stereotax، ثم قم بإزالة لوحة الرأس من شريط (الشكل 3I).
25. إزالة الحيوان من stereotax وإدارة الرعاية والمراقبة اللاحقة للعمليات الجراحية وفقا لكل القواعد واللوائح والقوانين (على سبيل المثال، البوبرينورفين 0.02 مغ / كغ، كل 8-12 ساعة مدة لا تقل عن 24ساعة). إذا التهاب يتطور حول حواف الزرع، وتطبيق طبقة رقيقة من مرهم مضاد حيوي لموقع المتضررين يوميا حتى حلها.

3. رصد Juxtacellular من وحدات الخلايا العصبية

1. سحب الكوارتز أنابيب الشعرية على غاز ثاني أكسيد الكربون ممص مكروى الليزر مجتذب (انظر القسم المعدات) بأقطار غيض من أقل من 1 ميكرون (الشكل 5A).
   ملاحظة: سوف تختلف المعلمات التدفئة وفقا لأداة معينة، وأن قطر الرقبة المطلوبة سوف تختلف تبعا لبنية الدماغ من الفائدة. للتسجيلات في المهاد الفئران، بال micropipettes لها أعناق تتراوح 5-7 ملم.
2. تأمين ماصة في مكان تحت المجهر النقيض تدخل الفرق (DIC) مجهزة أهداف العمل الطويلة المسافة. استخدام الصلصال لعقد ماصة في مكان على المسرح المجهر.
3. التحرك ببطء كتلة الزجاج (0،5-1 سم سميكة، قطعة من الزجاج تستخدم لماكالسكاكين مشراح جدا جي مريحة) في مجال الرؤية مع طرف ماصة. باستخدام مياداة مجهرية المرحلة، المس بلطف طرف ماصة على الزجاج، الامر الذي ادى الى كسر. كرر حسب الضرورة حتى ماصة قطرها الخارجي هو بين 1-3 ميكرون (الشكل 5B، C). التأكد من أن هذه بال micropipettes لها ممانعات بين ما يقرب من 5-15 MΩ.
4. إعداد المالحة خارج الخلية (135 مم كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 1.8 ملي CaCl _2، 1 ملم MgCl _2، 5 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم) ⁸ وإضافة 2٪ (ث / ت) شيكاغو السماء الزرقاء. باستخدام حقنة بإبرة G 30 أو أصغر، وملء نهاية الجزء الخلفي من ماصة مع الحل. بدلا من ذلك، لخلية واحدة وضع العلامات juxtacellular إضافة 2٪ (ث / ت) Neurobiotin أو أمين ديكستران المعقدة البيروكسيديز (BDA-3000 أو BDA-10000) إلى محلول ملحي في مكان شيكاغو السماء الزرقاء.
5. وضع الفئران داخل جورب من القماش داخل الأنبوب جامدة على رقصة التجريبية المناسبة ( الشكل 4) .Wait ما لا يقل عن 72 ساعة بعد الجراحة قبل وضع الحيوان على رقصة الرأس ضبط النفس. تشديد الرباط حول القص العلوي، بدلا من الرقبة، لتجنب انسداد مجرى الهواء. إذا ظهر التنفس إلى أن جاهد أو إعاقة، وتخفف من الرباط أو تحريكه من الخلف. تنفيذ هذا الإجراء في حين أن الفئران هو في حالة تأهب.
6. نعلق لوحة الرأس زجرية على الفئران على قطعة المقابل على رقصة. للقيام بذلك، أولا يعلقون لوحة وجها لضبط النفس في المكان، ثم ثبته باستخدام 4-40 المسمار. مما لا شك فيه أن تنتظر حتى الحيوان هو الهدوء من أجل تجنب تطبيق عزم الدوران المفرط في الرأس. وبعد ذلك، وضع الجوز 8-32 على الترباس تقييد الرأس الذي هو مزروع على الفئران. ثم المسمار في الخيوط قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ لرئيس الترباس. يضعوا قضيب إلى رقصة التجريبية في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن شددت في مكان (الشكل 4).
   ملاحظة: تأمين الحيوان مع رئيس الترباس فضلا عن لوحة وجها لضبط النفس دقيقةimizes الانحناء للأجهزة ويحسن الاستقرار التسجيل. في معظم الحالات يمكن تسجيل تبدأ في اليوم الأول من الحيوان هو-ضبط النفس الرأس. ومع ذلك، إذا يتململ الحيوان بشكل مفرط أو يتذرع، وتوفير يوم واحد من الرأس ضبط النفس التدريب التعود قبل بدء أي تسجيلات. في هذه الحالة، وترك الحيوان على رقصة لمدة 15 دقيقة ومن ثم وضعها مرة أخرى في قفصه. كرر هذه الخطوة في اليوم التالي وتواصل مع البروتوكول.
7. فتح غرفة تسجيل وإزالة هلام السيليكون. تنظيف حج القحف باستخدام ملقط غرامة إذا الأنسجة وإعادة نمت في حج القحف.
8. إرفاق ماصة للمياداة مجهرية الآلية، والمكونات في headstage قبل مكبر للصوت.
   ملاحظة: في مظاهرة الحالية، يتم استخدام الدائرة تتابع صغيرة على headstage للتبديل بين أسلاك من الرصاص مكبر للصوت ومصدر الجاري الخارجي مع الامتثال عالية (الشكل 6A-C). لاحظ أن بعض مكبرات الصوت لديها الاقتضاء المدمج في مصدر الامتثال عالية(انظر الأقسام مناقشة والمواد).
9. استخدام مياداة مجهرية الآلية للتحرك غيض من ماصة لعلامة حددت stereotaxically في غرفة تسجيل. ملاحظة إحداثيات هذا الموقع. يجب الحرص على عدم كسر غيض من ماصة على الجمجمة.
10. نقل ماصة إلى الموقع التسجيل المطلوب في المحاور الأمامية-الخلفية وميديو الأطراف. ثم دفع ماصة البطني من خلال الجافية إلى أن ما يقرب من 500 ميكرون الظهرية إلى الموقع تسجيل المقصود.
11. تقدم ببطء ماصة أثناء الاستماع لارتفاعه الأحداث على رصد الصوت من الجهد تضخيم سجلت بين طرف ماصة وسلك المرجعية. وبمجرد تحديد ارتفاعه الأحداث، والاستمرار في تحريك ميكرون ماصة 0-100 حتى الانحرافات الإيجابية الذهاب الجهد أكبر من ويلاحظ ما يقرب من 500 μV.
    ملاحظة: إن المقاومة القطب تزيد بعامل حوالي 1،5 حتي 10 WHأون يحدث هذا.
12. بدء تسجيل مرة واحدة وقد تم عزل وحدة كما وفقا لخطوة 3.11، جنبا إلى جنب مع جميع التدابير السلوكية والفسيولوجية الأخرى المثيرة للاهتمام. في التظاهرة الحالية، ويتم رصد تحركات شعرة أنفية المولدة ذاتيا مع سرعة عالية بالفيديو (انظر قسم المواد).
13. لتسمية الموقع تسجيل، والتبديل القطب يؤدي إلى الاتصال بمصدر الحالي. هناك عدة طرق للقيام بذلك، وذلك باستخدام إما الدائرة تتابع (الشكل 6A - C)، المدمج في مصدر الحالي على مكبر للصوت، أو يدويا (الشكل 6D، راجع الخطوة 3.8 ومناقشة). تمرير -4 أمبير مع 2 البقول ثانية في دورة العمل 50٪ لمدة 4 دقائق لحقن iontophoretically شيكاغو السماء الزرقاء من خلال ماصة.
14. قتل ويروي الحيوان بعد عدة إجراءات وضع العلامات وفقا للممارسة القياسية. قسم المخ ومباين الضرورة لتحديد موقع التشريحي للتسجيل الجلوسه. مباين الأنسجة لالسيتوكروم أوكسيديز التفاعل وفقا ^ل14. بدلا من ذلك، التعرف على الودائع شيكاغو السماء الزرقاء باستخدام المجهر مضان.
    ملاحظة: لتفرق بدقة بين وحدات مختلفة وصفت من المهم أن يتم إجراء كافة العلامات مع نفس ماصة في اليوم نفسه، دون unclamping ماصة بين العلامات. في هذه الحالة يمكن التفريق بين مواقع التسجيل عن طريق المواقع النسبية في الأنسجة بعد خاصة مع إحداثيات تتلاعب أشار كل موقع (راجع الخطوة 3.9). لتحديد لا لبس فيه، بمناسبة التسميات لا يقل عن 200 ميكرون وبصرف النظر عن بعضها البعض، وليس أكثر من 3-5 تسميات لكل منطقة في الدماغ.

النتائج

الوحدات العصبية في بطني الخلفي وسطي (VPM) المهاد ترميز مرحلة حركة شعرة أنفية أثناء المولدة ذاتيا الخفق ^15،16. ويبين الشكل 7A عينة النشاط ارتفاعه وحدة المهادية VPM كما الفئران والخفق بنشاط. ويبين الشكل 7B الرسم البياني للارتفاع مرات محاذاة إلى الم...

Discussion

بناء رقصة التجريبية

تم حذف وصف الأجزاء الميكانيكية المستخدمة لبناء رقصة التجريبية (الشكل 4) من البروتوكول، كما أنه يمكن بناؤها في مجموعة متنوعة من الطرق. في هذا المعيار مظاهرة تستخدم البصريات الميكانيك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063