ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש

Summary

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Abstract

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Introduction

ניטור פעילות עצבית בבעלי חיים ערניים המעורבים באופן פעיל במשימה התנהגותית הוא קריטי להבנת התפקוד והארגון של מערכת העצבים. הקלטה תאית של הפעילות החשמלית מיחידות עצביות אחת כבר זמן רב כלי עיקרי של מדעי מוח ומערכות עדיין נרחב בשימוש כיום. מגוון רחב של סוגי אלקטרודה ותצורות זמינים בהתאם לדרישות המדעיות וטכניות של ניסוי מסוים. כרוני מושתל microdrives או מערכי אלקטרודה משמשים לעתים קרובות בבעלי חיים לנוע בחופשיות, כוללים ציפורים, מכרסמים, ופרימטים שאינם בני אדם ^1-4. לחלופין, חדירות חריפות עם microelectrodes מתכת או זכוכית באמצעות micromanipulator חיצוני משמשות לעתים קרובות כדי להקליט מבעלי חיים מורדמים או-מרוסן ראש. יש לי אלקטרודות micropipette זכוכית היתרון שהם יכולים לשמש בjuxtacellular או "תא מצורף" תצורה לבודד באופן חד משמעיפעילות של נוירונים בודדים ללא סיבוכים של ספייק פוסט הוק-מיון ^5. אלקטרודות אלה נוספים מאפשרות הקלטה מהתאים או במקומות אנטומית-מזוהים, כפי שהם יכולים להשתמש בהם כדי להזריק פיקדונות קטנים של קליעים נותבים צבע או neuroanatomical, או אפילו כדי למלא את הפרט נרשם תא. תצורה זו יושמה בהצלחה בחולדות, עכברים וציפורים ^6-10. הטכניקה המתוארת כיום מתמקדת בניטור juxtacellular ופיקדונות צבע תאיים בכוננות, חולדות-מרוסן ראש. שים לב שתא בודד בניגוד juxtacellular ממלא, פיקדונות צבע אלה אינם מספקים מידע על מורפולוגיה של תאים או תחזיות axonal ^11, אבל הם מאפשרים לוקליזציה אנטומי מדויקת לכ -50 מיקרומטר ו, ביקורתי, בעלי תשואה גבוהה באופן משמעותי בבעלי חיים ערניים. מידע בדבר תא בודד juxtacellular ממלא מסופק בכל זאת כאסטרטגיה חלופית לתיוג אנטומיים.

בקיצור,פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. בשלב הראשון, החולדה התאקלמה לריסון גוף בגרב בד (איור 1) על פני תקופה של 6 ימים. בשלב השני, מנגנון משענת ראש (איור 2) ותא הקלטה מושתל בניתוח כזה שהחולדה יכולה להישמר במטוס stereotaxic במהלך פגישות מרובות שלאחר מכן הקלטה (איור 3); הליך זה מאפשר הנסיין למקד אזורים תת-קליפת המוח מסוימים של המוח למחקר אלקטרו מבוסס על התייחסות סטנדרטית קואורדינטות ^12. השלב השלישי כולל הצבת העכברוש בלנענע מתאים לביצוע ניסויים התנהגותיים ואלקטרו (איור 4), בניית האלקטרודה מצינור נימי קוורץ (איור 5), מה שהופך את הקלטות עצביות juxtacellular שבאופן חד משמעי לבודד יחידות בודדות ^6-9, ו סימון locati אנטומייםבאתר ההקלטה עם צבע שיקגו סקיי בלו (איורים 6 ו -7). ההקלטות מבוצעות עם ניטור התנהגות בו-זמנית; עם זאת, לפרטים הטכניים של ההתנהגות יהיו תלויים במטרות המדעיות של כל ניסוי ולכן הם מעבר להיקף של פרוטוקול יחיד. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, שניתן לחזור על ימים מרובים, החיה מורדמים. המוח מופק ומעובד על פי טכניקות neuroanatomical סטנדרטיים או באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protocol

פרוטוקולי ניסוי בוצעו על חולדות נקבות ארוכות אוונס (250-350 גר ') בהתאם להנחיות טיפול בבעלי החיים ושימוש שנקבעו פדרלי ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו.

1. להתאקלם העכברוש לגוף איפוק

הערה: מניחים את החולדה בדיאטה מוגבלת. להאכיל את העכברוש פעם ביום באופן מיידי לאחר כל פגישת טיפול יומית להסתגל החולדה לריסון (שיפורט להלן). לספק מספיק מזון כדי לשמור על בעלי החיים ב- 80% מהמשקל ההתחלתי שלה. סכום זה הנו כ 6 גרם של מזון ליום לחולדה הארוך אוונס 250 נקבת g.

1. להסתגל החולדה למטופל על ידי בני אדם. בעדינות לרסן את החולדה ביד לתקופות של כ 5 שניות כל 30 שניות. לעשות את זה במשך 15 דקות ביום על 2 ימים רצופים. לפקח על החולדות יומיות לסימנים של לחץ בתקופת ההכשרה. סימנים כוללים נאבקים iתגובת n לאיפוק, ניקוד, ושיניו נוקשות.
2. ביום 3 ^rd, למקם את העכברוש בגרב בד-מגבילים גוף (איור 1) במשך 15 דקות ביום על שני ימים רצופים.
3. ביום ^ה -5, מניח את החולדה בתוך הגרב, ולמקם את הגרב בתוך צינור נוקשה על לנענע הניסוי (איור 4). השאר את העכברוש בצינור במשך 15 דקות ביום על 2 ימים רצופים.
4. להאכיל את העכברים מייד לאחר כל אימון. בסוף הפגישה האחרונה (יום ^ה 6) לתת גישה חופשית למזון. בחר להשתלה רק אלה חולדות שלא מראים סימנים של לחץ מוגזם על יום האימונים האחרון.
   הערה: למרות שהבחירה של חולדות להשתלה היא סובייקטיבי, בידיים שלנו מעל 90% מחולדות נמצאו להיות קשובים להתרגלות ותוכל לעבור השתלה.

2. השתלת מנגנון הקלטת הלשכה וראש-איפוק

1. הפוך מחדשference חוט על ידי הלחמה חוט נירוסטה חשופה לפינים. חותך את החוט כך ששרידי 3-5 מ"מ נחשפו על ידי הסיכה. החיטוי חוט ההתייחסות, יחד עם כל הכלים כירורגיים.
2. לנהל קטמין / הרדמה xylazine. לנהל 95 מ"ג / קילוגרם קטמין מעורבב עם 5 מ"ג / קילוגרם xylazine intraperitoneally. המינון הראשוני נמשך ½ 1 עד 2 שעות. להשלים את כל ההרדמה דקות 30-45 לאחר מכן, במידת הצורך. לשמן את עיניו של בעל החיים עם משחת עיניים.
3. בדוק את רפלקס נסיגת הבוהן כדי לקבוע את המטוס של הרדמה, ולשמור על הרדמה במידת צורך.
4. מניחים את החולדה במסגרת החזקת stereotaxic עם ברים אוזן (איור 3 א). לגלח את השיער על הראש ולחטא את הפצע עם אתר povidone- יוד (פתרון של 10%). דואג להכניס את הברים האוזן כראוי, כך שהם לא גורמים נזק לעור התוף. ברים אוזן עם טיפים בוטים עדיפים.
5. עושה חתך עם אזמל approxiשל דבר לאורך קו האמצע של הגולגולת מרמת rostro- הזנב של העיניים לחלק האחורי של האוזניים. השתמש במספריים כדי לחתוך ולהסיר רצועת 2-3 מ"מ של עור בכל צד של החתך.
6. לגרד מן periosteum לחשוף את פני השטח של הגולגולת לרכסים לרוחב. מכסה את הגולגולת החשופה עם שכבה דקה של דבק מגע.
7. לקדוח חור קטן, בקוטר מעט קטן יותר מ0-80 ברגים, באמצעות בר תרגיל ½ מ"מ קוטר (ראה סעיף חומרים). לקדוח החור אחורי מייד למקום שבי תפר גבחת עומד ברכס לרוחב, ובזווית 30-45 מעלות לתוך הגולגולת, כך שהבורג יכול ללכת עם הראש יותר לרוחב מאשר לתחתית.
8. לדפוק בבורג 0-80 מכונה בעלת תחתונה לחור (תור כ 3), ב30-45 מעלות זווית. היזהר שלא ידפקו בעמוק מדי כדי למנוע נזק לרקמת המוח הבסיסי.
9. חזור על תהליך זה עבור 6 ברגים נוספים בתצורה מוצגים (איור 3). החל דבק מגע לבסיס של כל הברגים.
10. הנח מחט מזרק במניפולטור stereotax. מדוד מתפר גבחת, ולעשות שקע בגולגולת עם המחט ליד, אבל מחוץ למיקום craniotomy הרצוי, כסימן הפניה.
    הערה: בהפגנה זו, קואורדינטות stereotaxic של הסימן 3 מ"מ אחורי ו -1 מ"מ לרוחב תפר גבחת.
11. סמן את השקע עם סמן קבע. שים לב לקואורדינטות stereotaxic של הסימן, כפי שהוא ישמש כנקודת התייחסות stereotaxic (איור 3).
12. הפוך craniotomy התמקד בקואורדינטות הרצויות (האחורי 3 מ"מ ו -3 מ"מ לרוחב גבחת בדוגמא זו). השאר את מאטר הדורה ללא פגע. מכסה את craniotomy עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי שונה (125 מ"מ NaCl, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, 3.1 מ"מ CaCl _2, 1.3 מ"מ MgCl _2, pH 7.4) ¹³ (איור 3 ג).
13. חותך צינור 0.2 מיליליטר צנטריפוגות - 4, 5 מ"מ באורך, ולנתק את הכובע. מניחים את הצינור על הגולגולת ולמרכז אותו על פתיחת הגולגולת.
14. החל מלט שיניים סביב החלק התחתון של הצינור כדי לאטום את הבסיס של הצינור לגולגולת. היזהר שלא ידלפו מלט לפתיחת הגולגולת החשופה (איור 3D).
15. לקדוח חור נוסף קטן (כ ½ מ"מ קוטר) בצלחת הגולגולת הנגדית והכנס את חוט ההתייחסות בזהירות. לבנות את חוט ההתייחסות ידי הלחמה פינים ממשקים עם מגבר ההקלטה לקצה של החוט (ראה סעיף ציוד). אל תזיז את חוט התייחסות פעם אחת זה במוח כעלול לגרום לניזק זה.
16. החל דבק מגע לחור שבו החוט הוכנס. זה לאטום את הסיכה ותיל במקום באופן זמני.
17. מערבבים את שני חלקים של ערכת ג'ל סיליקון (ראה סעיף חומרים) במנות שווה בערך. המתן שתי דקות לערבוב וfill צינור צנטריפוגות כ ⅓ מלא עם ג'ל.
18. צרף הודעה זווית מהדק תקין (ראה סעיף חומרים) לבר משענת הראש. צרף את צלחת הראש (איור 2 א) לבר ההחזקה (איור 2) בזווית של 45 מעלות המגרש, כך שהחלק התחתון של הצלחת הוא לכיוון אפו של בעל החיים. זה מועיל להשתמש שיפוע כדי לקבוע את זווית המגרש כדי להתאים את זה של לנענע ניסוי (איור 4).
19. צרף את בר ההחזקה לזרוע מניפולטור stereotax כך שהבר מקביל לברים האוזן. מנמיכים את בר וצלחת כך שהצלחת היא אחורית של התפר למבדה וקדמית לזנב ביותר-הבורג.
20. לתפוס את ראש הבורג הקדמי (8-32 הרבעה או בורג, ראה סעיף חומרים) בכ -45 ° זווית עם זרוע ותפס ידיים עוזרת, כך שהראש של הבורג פונה כלפי מטה וכיוון הזנב של החיה. מנמיכים את הבורג כך שהוא נוגע בנמליםerior 0-80 ברגים (איור 3F, G).
21. לאבטח את הבורג וצלחת במקום עם אקריליק שיניים. החל אקריליק שיניים סביב ראשי בורג עצם, סיכת התייחסות, וסביב הצדדים של צינור צנטריפוגות. חכה כ 10 דקות לאקריליק השיניים לייבוש (איור 3H).
22. למרוח שכבה של דבק דנטלי מסביב לקצוות של אקריליק השיניים, מלט העור לשתל. חכה לבטון לייבוש.
23. נקוב כמה חורים במכסה של צינור צנטריפוגות, והנח את הכובע על הצינור.
24. הסר את מהדק הידיים עוזר. ואז להסיר בזהירות את בר מחזיק את הראש מstereotax, ולאחר מכן להסיר את צלחת ראש משורת (איור 3I).
25. הסר את החיה מstereotax ולנהל טיפול ומעקב לאחר ניתוח בהתאם לכל הכללים, תקנות והחוקים החלים (לדוגמא, גבופרנורפין 0.02 / קילוגרם, כל שעה 8-12 למינימום של 24שעה). אם דלקת שמתפתחת סביב הקצוות של השתל, למרוח שכבה דקה של משחה אנטיביוטית לאתר המושפע מדי יום עד נפתר.

3. ניטור Juxtacellular יחידות עצביים

1. משוך צינור נימי קוורץ על חולץ micropipette לייזר פחמן דו חמצני (ראה סעיף ציוד) בקטרים ​​קצה של פחות מ 1 מיקרומטר (איור 5 א).
   הערה: הפרמטרים החימום ישתנו בהתאם למכשיר המסוים, ושקוטר הצוואר הנדרש ישתנה בהתאם למבנה המוח של עניין. להקלטות בתלמוס חולדה, יש לי micropipettes צוואר החל 5-7 מ"מ.
2. אבטח את פיפטה במקום תחת מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מצויד ביעדי מרחק עבודה ארוכה. השתמש בפלסטלינה להחזיק פיפטה במקום בשלב של מיקרוסקופ.
3. לאט לאט להזיז בלוק זכוכית (0.5-1 סנטימטר עובי; חתיכת הזכוכית המשמשת לMaking סכיני אולטרה microtome נוח) לשדה ראייה עם קצה פיפטה. שימוש micromanipulator השלב, לגעת בעדינות את קצה פיפטה לזכוכית, גורם לו לשבור. חזור על צורך עד הקוטר החיצוני קצה פיפטה הוא בין 1-3 מיקרומטר (איור 5 ב, ג). ודא שיש לי micropipettes אלה עכבות בין כ 5-15 MΩ.
4. הכן מלוח תאי (135 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl _2, 1 מ"מ MgCl _2, 5 מ"מ HEPES, pH 7.2 עם NaOH) ⁸ ולהוסיף 2% (w / v) שיקגו שמיים כחולים. באמצעות מזרק עם מחט 30 G או קטן יותר, למלא את הקצה האחורי של פיפטה עם הפתרון. לחלופין, לתיוג juxtacellular תא בודד להוסיף 2% (w / v) Neurobiotin או אמין dextran biotinylated (BDA-3000 או BDA-10000) לתמיסת מלח במקום של שיקגו שמיים כחולים.
5. מניחים את החולדה בתוך גרב הבד בתוך הצינור הנוקשה על לנענע ניסוי מתאים ( איור 4) .Wait מינימום של 72 שעות לאחר ניתוח לפני הצבת בעלי החיים בלנענע את הראש-האיפוק. הדק את השרוך ​​סביב עצם החזה העליון, ולא בצוואר, כדי להימנע מחסימה של דרכי הנשימה. אם נשימה נראה שעמלה או חסום, שחרר את השרוך ​​או להעביר אותה בדיעבד. לבצע הליך זה בזמן שהחולדה היא ערנית.
6. צרף את צלחת הראש-מרסן על החולדה לכתבה על לנענע המקבילה. כדי לעשות זאת, להצמיד ראשון צלחת הראש-איפוק במקום, ולאחר מכן לאבטח אותו באמצעות בורג 4-40. הקפד לחכות עד שהחיה היא רגועה על מנת להימנע מהחלת מומנט מוגזם לראש. בשלב הבא, מקום אגוז 8-32 בבורג ריסון-הראש שמושתל בחולדה. אז בורג במוט פלדת אל-חלד הברגה לראש הבורג. הצמד את המוט ללנענע הניסיוני באופן כזה שהוא יכול להדק במקום (איור 4).
   הערה: אבטחת החיה עם הראש-בורג, כמו גם את דקות צלחת הראש-איפוקimizes כיפוף של המנגנון ומשפר את יציבות הקלטה. ברוב המקרים הקלטה יכולה להתחיל ביום הראשון של בעלי החיים הוא-מרוסן ראש. עם זאת, אם בעל החיים בעצבנות יתר על המידה או vocalizes, לספק יום אחד של אימוני התרגלות הראש-איפוק לפני תחילת כל הקלטות. במקרה זה, להשאיר את החיה על לנענע במשך 15 דקות ולאחר מכן למקם אותו בחזרה בכלוב שלה. חזור על שלב זה ביום שלמחרת ולהמשיך בפרוטוקול.
7. פתח את תא ההקלטה ולהסיר את ג'ל סיליקון. נקה את פתיחת הגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר אם רקמות מחדש גדלו בפתיחת הגולגולת.
8. צרף את פיפטה micromanipulator הממונע, וחבר בקדם-מגבר headstage.
   הערה: בהפגנה הנוכחית, מעגל ממסר קטן על headstage משמש למעבר בין החוטים להוביל מגבר ומקור זרם חיצוני עם תאימות גבוהה (איור 6 א-ג). שימו לב שיש כמה מגברים מתאימים מובנים במקור גבוה תאימות(ראה סעיפי דיון וחומרים).
9. השתמש micromanipulator הממונע כדי להזיז את הקצה של פיפטה לסימן המזוהה stereotaxically בחדר ההקלטה. שים לב לקואורדינטות של מיקום זה. היזהר שלא לשבור את הקצה של פיפטה בגולגולת.
10. הזז את פיפטה למיקום הרצוי בהקלטת הצירים הקדמי, האחוריים וMedio-צדדיים. לאחר מכן לקדם את פיפטה ventrally דרך הדורה עד שהוא כ 500 מיקרומטר גב למיקום ההקלטה המיועד.
11. לאט לאט לקדם את פיפטה בעת ההאזנה ללהתחדד אירועים על צג שמע של המתח המוגבר נרשם בין קצה פיפטה וחוט ההתייחסות. ברגע שאירועים להתחדד מזוהים, תמשיך לנוע מיקרומטר פיפטה 0-100 עד deflections מתח הולך חיובית יותר מאשר כ -500 μV הם נצפו.
    הערה: התנגדות האלקטרודה תגדל בפקטור של כ 1.5-10 ש"שen זה מתרחש.
12. להתחיל בהקלטה אחת ליחידה כבר מבודדת כפי צעד 3.11, יחד עם כל אמצעים התנהגותיים ופיסיולוגיים האחרים של עניין. בהפגנה הנוכחית, תנועות vibrissa עצמית שנוצר בפיקוח עם צילום וידאו במהירות גבוהה (ראה סעיף חומרים).
13. לתייג את אתר ההקלטה, לעבור את האלקטרודה מובילה להתחבר למקור הזרם. יש כמה דרכים לעשות את זה, או באמצעות מעגל ממסר (איור 6 א - ג), (איור 6 ד, ראה שלב 3.8 ודיון) מובנה במקור זרם במגבר, או באופן ידני. לעבור -4 מייקרו-אמפר עם 2 פעימות לשנייה ב 50% מחזור למשך 4 דקות להזריק iontophoretically שיקגו שמיים כחולים באמצעות פיפטה.
14. הרוג ואנקב את החיה לאחר מספר הליכי תיוג על פי מקובל. סעיף המוח וcounterstain כנדרש כדי לזהות את המיקום האנטומי של ההקלטה לשבתדואר. Counterstain הרקמה לתגובתיות מונואמין ציטוכרום לפי ^14. לחלופין, לזהות את פיקדונות שיקגו שמיים כחולים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: כדי להבדיל באופן מדויק בין יחידות שונות שכותרתו חשובה שכל התוויות נעשות עם אותו פיפטה באותו היום, ללא unclamping פיפטה בין תוויות. במקרה זה יכול להיות מובחן אתרי הקלטה על ידי המיקומים היחסי שלהם בהיסטולוגיה פוסט-הוק יחד עם קואורדינטות מניפולטור ציינו של כל אתר (ראה שלב 3.9). לזיהוי חד משמעי, לסמן את התוויות בהפרש של לפחות 200 מיקרומטר זו מזו, ולא יותר מ3-5 תוויות לאזור במוח.

תוצאות

יחידות עצביות בהמדיאלי אחורי הגחון (VPM) התלמוס לקודד את השלב של תנועת vibrissa במהלך עצמי שנוצר ומעיף ^15,16. איור 7 א מציג מדגם פעילות spiking של יחידת התלמוס VPM כחולדה הנעים במהירות באופן פעיל. איור 7 מציגה היסטוגרמה של ספייק פעמים מיושרות לשלב המיידי ...

Discussion

בנייה לנענע הניסיוני

התיאור של החלקים מכאניים המשמשים לבנייה לנענע הניסוי (איור 4) מושמט מן הפרוטוקול, כפי שהוא יכול להיות בנוי במגוון דרכים. בהפגנה זו סטנדרטית אופטו-מכאני חלקים ומהדק תמיכה משמש להר בר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063