경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

요약

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

초록

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

서문

적극적으로 행동 작업에 종사하는 경고 동물에서 신경 세포의 활동을 모니터링 신경계의 기능과 조직을 이해하는 것이 중요합니다. 하나의 신경 세포 단위에서 전기 활동의 세포 외 녹음이 긴 시스템 신경 과학의 주식 도구 왔으며 현재 광범위하게 사용되고 여전히있다. 전극의 종류와 구성의 다양 한 특정 실험의 과학적, 기술적 요구에 따라 사용할 수 있습니다. 만성 또는 마이크로 드라이브를 주입 전극 배열은 종종 조류, 설치류 및 영장류를 포함 ^1-4 자유롭게 움직이는 동물에서 사용된다. 또한, 외부 미세 조작기를 통해 금속 또는 유리 미세 전극 급성 관통 자주 마취 또는 머리를 억제 동물에서 기록하는 데 사용됩니다. 유리 마이크로 피펫 전극들이 사용될 juxtacellular 또는 "세포 부착"될 수있는 이점이 명백하게 구성을 분리^{5 정렬} 사후 스파이크의 합병증없이 단일 뉴런의 활동. 이들이 염료 또는 신경 해부학 트레이서 작은 예금을 주입하는, 또는 심지어는 개개의 셀을 기록 채우기 위해 사용될 수있다 이들 전극은 또한, - 식별 된 해부학 세포 또는 위치에서의 기록을 허용한다. 이 구성은 성공적으로 쥐, 마우스, 조류 ^6-10에 적용되었습니다. 현재 기술 기술은 juxtacellular 모니터링 및 경고에 ​​세포 외 색소 침착, 머리 억제 쥐에 초점을 맞추고있다. 이러한 염료 보증금은 세포 형태 또는 축삭 돌기 ^(11)에 대한 정보를 제공하지 않는 채 웁니다 juxtacellular는 달리 하나의 셀을 참고하지만 그들은 경고 동물에서 상당히 높은 수율을 가지고 비판적으로, 약 50 μm의 정확한 해부학 적 위치 파악을 가능하게합니다. 그럼에도 불구하고 해부학 라벨링을위한 대안 전략으로 제공됩니다 채워 juxtacellular 단일 셀에 대한 정보.

요컨대,프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서, 래트 6 일의 기간에 걸쳐 천 깔창 (도 1) 신체 구속에 순응된다. 두 번째 단계에서, 헤드 레스트 장치 (도 2) 기록 챔버 수술 래트에 여러 후속 기록 회의 (도 3) 중에 정위 평면에서 유지 될 수 있도록 주입; 이 절차는 표준 참조 ⁽¹²⁾ 좌표를 기반으로 전기 생리학 연구를 위해 뇌의 특정 하위 대뇌 피질의 영역을 대상으로 실험을 할 수 있습니다. 세 번째 단계는 명백하게 하나의 단위로 ^6-9을 분리 juxtacellular 신경 녹음을, (그림 5) 석영 모세관 튜브에서 전극을 구성, 행동 적, 전기 생리 실험 (그림 4)를 수행하기에 적합한 지그에 쥐를 배치 포함하고, 해부학 locati 마킹시카고 스카이 블루 염료 (도 6 및도 7)와 기록 사이트에서. 녹음 동시 행동 모니터링을 수행; 그러나, 행동의 기술적 인 세부 사항은 각 실험의 과학적 목표에 따라 달라집니다 단일 프로토콜의 범위를 벗어 포함된다. 여러 일에 반복 될 수 실험 절차의 종료 후, 동물은 안락사된다. 뇌는 시야 또는 형광 현미경을 사용하여 표준 신경 해부학 적 기술에 따라 추출 및 처리됩니다.

프로토콜

연방 정부가 규정 된 동물 관리 및 사용 지침에 따라 - (350 g을 250)와 캘리포니아 샌디에고 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 실험 프로토콜은 여성 롱 에반스 쥐에서 수행되었다.

1. 신체 구속에 쥐 익숙해 질

참고 : 제한된 다이어트에 쥐를 놓습니다. 구속 (아래에서 설명)에 쥐를 적응 즉시 각 매일 처리 세션 후 하루에 한 번 쥐를 넣습니다. 초기 체중의 80 %에서 동물을 유지하기에 충분한 공급을 제공합니다. 이 금액은 250g 여성 롱 에반스 쥐에 대한 하루 공급의 약 6g이다.

1. 인간에 ​​의해 처리되기 쥐를 적응. 부드럽게 약 5 초마다 30 초 동안 손으로 쥐를 억제. 2 일 연속 15 분 하루 동안이 작업을 수행합니다. 훈련 기간 동안 스트레스의 징후를 매일 쥐를 모니터링합니다. 징후 내가 어려움을 겪고 포함구속, 발성, 치아 채터에 n 개의 응답.
2. 제 ³ 회 ^하루에 15 분 이틀 연속에 하루 동안 신체 구속 천 양말 (그림 1)에 쥐를 놓습니다.
3. 5 ^번째 날, 양말 내부의 쥐를 배치하고 실험 지그에 단단한 튜브 (그림 4) 내부의 양말을 배치합니다. 2 일 연속 15 분 하루 동안 튜브에 쥐를 남겨주세요.
4. 각 훈련 직후 쥐 피드. 마지막 세션 (6 ^일째)의 끝에서 음식에 제한없이 액세스 할 수 있습니다. 주입을위한 마지막 훈련을 하루에 과도한 스트레스의 징후를 표시하지 않습니다 만 쥐를 선택합니다.
   참고 : 주입 쥐의 선택은 우리의 손에, 주관적이지만 쥐의 90 % 이상이 습관화에 반응과 이식을 받아야 할 것으로 밝혀졌다.

2. 기록 회의소 헤드 억제 메커니즘을 주입

1. 다시 확인핀 커넥터에 베어 스테인레스 스틸 와이어를 납땜 전파 방해 와이어. 3-5mm의 유적이 핀에 의해 발견 있도록 전선을 잘라. 모든 수술 도구와 함께, 기준 선을 압력솥.
2. 케타민 / 자일 라진 마취를 관리. 95 ㎎ / 복강 / kg 자일 라진 (xylazine) 5 mg을 혼합 kg 케타민을 관리합니다. 초기 용량은 1.5 ~ 2 시간 동안 지속됩니다. 필요에 따라, 모든 30 ~ 45 분 후 마취를 보충. 안과 연고와 동물의 눈을 윤활합니다.
3. 마취의 평면을 결정하고, 필요에 따라 마취를 유지하기 위해 발가락 철수 반사를 확인합니다.
4. 귀 바 정위 유지 프레임에 쥐를 놓습니다 (그림 3A). 머리에 모발을 면도 포비돈 요오드 (10 % 용액)와 상처 부위를 소독. 그들은 고막에 손상을주지 않도록 적절하게 귀 막대를 삽입 할주의하십시오. 이어 무딘 팁 막대가 바람직하다.
5. 메스 approxi와 절개를합니다후면부로 귀 뒤쪽에 눈의 rostro - 꼬리 수준에서 두개골의 정중선을 따라. 절단 및 절개의 양쪽에 피부의 2 ~ 3 밀리미터 스트립을 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
6. 측면 능선에 밖으로 두개골의 표면을 노출 골막 멀리 다 쳤어요. superglue의 얇은 층으로 노출 된 두개골을 커버.
7. ½ mm 직경의 드릴을 이용하여 버어, 0-80 나사보다 약간 작은 직경의 작은 구멍을 뚫는다 (원료 섹션을 참조). 나사가 바닥보다 더 많은 측면 상단에 갈 수 있도록 구멍이 바로, 브레 그마 봉합이 측면 능선을 충족하고 두개골에 30 ~ 45 ° 각도로 위치로 후부 드릴.
8. 30 ~ 45 ° 각도로 구멍 (약 3 회전)에 0-80 평면 바닥 기계 나사에 나사. 기본 뇌 조직 손상을 방지하기 위해 너무 깊이에 나사하지 않도록주의하십시오.
9. 도시 된 구성에 추가로 나사 (6)에 대해이 절차를 반복 (그림 3B). 모든 나사의베이스에 superglue를 적용합니다.
10. stereotax 조작기에 주사기 바늘을 놓습니다. 기준 마크로서, 원하는 개두술 위치의 브레 그마 봉합에서 측정하고 근처 바늘 두개골에 구멍을 내 만들지 만, 외부.
    참고 :이 데모에서는, 마크의 정위 좌표가 3mm 후방와 브레 그마 봉합에 측면 1mm이다.
11. 영구 마커 덴트을 표시합니다. 이 정위 기준점이 될 것 같은, 마크의 정위 좌표를 참고 (그림 3B).
12. 원하는 좌표 (3mm 후방이 예에서 정수리하는 측면 3mm)을 중심으로 개두술을 확인합니다. 그대로 뇌경막을 남겨주세요. 수정 된 인공 뇌척수액으로 개두술을 커버 (125의 NaCl, 10mM 포도당, 10 mM의 HEPES, 3.1 mM의 염화칼슘 _2, 1.3 mM의의 MgCl _2, pH를 7.4) ⁽¹³⁾ (그림 3C).
13. (4)에 0.2 ml의 원심 분리 튜브 컷 - 길이 5 ㎜, 및 캡을 절단. 두개골에 튜브를 놓고 개두술에 그것을 중심.
14. 두개골에 튜브의 기부를 밀봉 튜브 바닥 주위 치과 시멘트 적용. 노출 개두술 (그림 3D)에 시멘트를 누출하지 않도록주의하십시오.
15. 반대쪽 두개골 판에 다른 작은 구멍 (약 ½ mm 직경) 드릴 조심스럽게 참조 와이어를 삽입합니다. (장치 섹션 참조) 와이어의 단부에, 기록 증폭기와 인터페이스 핀을 납땜 기준 선을 구축. 참조 와이어를 이동하지 마십시오 그것은이 발생할 수있는 손상과 뇌에 한 번.
16. 와이어가 삽입 된 구멍에 superglue를 적용합니다. 이것은 일시적으로 장소에 핀과 와이어를 밀봉합니다.
17. 실리콘 겔 키트의 두 부분 믹스 대략 동등한 부분 (원료 섹션을 참조). 혼합 FIL 2 분을 기다립니다L 원심 분리기 튜브 약 ⅓ 젤 전체.
18. 직각 포스트 클램프를 부착 헤드 구속 바 (자료 섹션 참조). 플레이트의 바닥은 동물의 코 향하도록 45 ° 피치 각도 유지 바 (도 2B)에 헤드 판 (도 2A)를 붙여. 이 실험 지그 (도 4)와 일치되도록 피치 각도를 설정 경사계를 사용하는 것이 도움이된다.
19. 막대가 귀 바 평행이되도​​록 stereotax 조작하는 팔에 들고 줄을 연결합니다. 판 꼬리 가장 나사에 람다 봉합과 전방의 후방가되도록 바, 플레이트를 낮 춥니 다.
20. 프론트 헤드 볼트 잡고 (8-32 스터드 또는 나사, 자료 섹션 참조) 나사의 머리가 아래로 동물의 꼬리쪽으로 향하도록, 도움의 손길 암과 클램프 약 45 ° 각도로. 이 개미에 닿을 수 있도록 나사를 내립니다erior 0-80 나사 (그림 3 층, G).
21. 치과 아크릴과 장소에 볼트와 플레이트를 고정합니다. 뼈 스크류 헤드 주위 치과 아크릴, 기준 핀을 적용하고, 원심 분리 튜브의 측면 주위. 치과 아크릴이 마를 때까지 약 10 분을 기다립니다 (그림 3H).
22. 임플란트에 피부를 확고히, 치과 아크릴의 가장자리 주위에 치과 시멘트의 층을 적용합니다. 시멘트가 마를 때까지 기다립니다.
23. 원심 분리기 튜브의 캡에 여러 구멍을 찌를, 튜브의 캡을 배치합니다.
24. 도움의 손길 클램프를 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 stereotax에서 머리를 들고 줄을 제거한 다음 줄 (그림 3I)에서 헤드 플레이트를 제거합니다.
25. stereotax에서 동물을 제거하고 모든 적용 가능한 규칙, 규정 및 법률 (에 따라 수술 후 관리 및 모니터링을 관리 예, 부 프레 놀핀 0.02 ㎎ / ㎏, 24의 최소마다 8 ~ 12 시간시간). 염증이 임플란트의 가장자리 주위에 개발하면 해결 될 때까지, 매일 영향을받는 사이트에 항생제 연고의 얇은 층을 적용합니다.

신경 단위의 3 Juxtacellular 모니터링

1. 이산화탄소 레이저 마이크로 피펫 풀러에 수정 모세관 튜브를 당겨 1 μm 미만이다 (도 5a)의 선단부 직경 (장치 섹션 참조).
   주 : 가열 파라미터는 특정 악기에 따라 다양하며, 필요한 목 직경 관심 뇌 구조에 따라 다를 것이다. 쥐의 시상에서 녹음을 위해, 마이크로 피펫은 5-7mm까지 올라 있습니다.
2. 긴 작동 거리 목표에 장착 된 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경 장소에 피펫을 고정합니다. 현미경의 무대에 장소에 피펫을 유지하는 점토를 사용합니다.
3. MAK에 사용 된 유리의 조각; 1cm 두께 - 0.5 천천히 유리 블록 (이동울트라 마이크로톰 나이프를 보내고하는 것은 피펫 팁과보기의 필드에) 편리합니다. 무대 미세 조작기 사용, 가볍게 휴식 원인, 유리 피펫 팁을 터치합니다. 피펫 팁의 외경은 1 내지 3 ㎛의 사이가 될 때까지 필요한만큼 반복 (그림 5B, C). 이러한 마이크로 피펫은 약 5 ~ 15 MΩ 사이의 임피던스를 가지고 있는지 확인하십시오.
4. 세포 외 식염수 (135 mM의 NaCl을, 5.4 mM의 KCl을, 1.8 mM의 염화칼슘 _2, 1 ㎜의 MgCl _2, NaOH로 5 mM의 HEPES, pH를 7.2) ^(8)을 준비하고 시카고 스카이 블루 (/ V W) 2 %를 추가합니다. 30 G 바늘 이하로 주사기를 사용하여, 용액을 피펫의 후단 채우기. 또한, 단일 셀 juxtacellular 라벨 2 %를 추가 (w / v)의 Neurobiotin 또는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA-3000 또는 BDA-10000) 시카고 스카이 블루 대신에 생리 식염수에.
5. 적절한 실험 지그에 단단한 튜브 내부의 천 양말 내부의 쥐를 놓습니다 ( 그림 4) .Wait 헤드 구속 지그에 동물을 배치하기 전에 수술 후 72 시간의 최소. 기도의 폐색을 방지하기 위해, 오히려 목보다 상부 흉골 주위에 조임끈을 조입니다. 호흡이 곤란한 또는 방해 할 나타나면, 조임끈을 풀거나 후방으로 이동합니다. 쥐가 경고 상태에서이 절차를 수행합니다.
6. 지그의 해당 부분에 쥐의 머리를 억제 플레이트를 연결합니다. 이렇게하려면 처음에 머리 구속 판을 고정하고 4-40 나사를 사용하여 고정합니다. 동물이 머리에 과도한 토크를 적용 피하기 위해 진정 될 때까지 대기해야합니다. 다음으로, 쥐에 이식 된 머리 억제 볼트에 8-32 너트를 배치합니다. 그런 다음 머리 볼트 나사 스테인리스 스틸 막대에 나사. 이 자리에 체결 될 수있는 방법 (그림 4)에서 실험 지그에로드를 붙입니다.
   참고 : 헤드 구속 플레이트 분뿐만 아니라 머리 볼트와 동물을 보호장치의 굽힘 imizes 및 기록 안정성을 향상시킵니다. 첫 날에 시작 할 수 있습니다 기록 대부분의 경우 동물은 머리를 억제합니다. 동물이 과도하게 fidgets 또는 vocalizes 경우, 모든 녹음을 시작하기 전에 머리 구속 습관화 훈련의 일일를 제공합니다. 이 경우에, 15 분 동안 지그에 동물을두고 그 후 케이지를 제자리. 다음날이 단계를 반복하고 프로토콜을 계속합니다.
7. 기록 챔버를 열고 실리콘 젤을 제거합니다. 조직은 개두술에 다시 성장 경우 미세 집게를 사용하여 개두술을 청소합니다.
8. 전동 미세 조작기에 피펫을 연결하고 headstage 프리 앰프에 연결합니다.
   참고 : 본 데모에서는 headstage에 작은 릴레이 회로는 증폭기 리드선과 높은 컴플라이언스 (도 6A-C)와 함께 외부의 전류원을 전환하는데 사용된다. 일부 앰프가 내장 적절한 높은 준수 소스를 가지고 있습니다(토론 및 재료 섹션 참조).
9. 녹화 실에서 stereotaxically 식별 표시로 피펫의 팁을 이동하는 전동 미세 조작기를 사용합니다. 이 위치의 좌표를합니다. 두개골에 피펫의 끝을 중단하지 않도록주의하십시오.
10. - 전방 후방 및 메디 오 - 측면 축에서 원하는 기록 위치에 피펫을 이동합니다. 그것이 의도 된 기록 위치에 약 500 μm의 지느러미가 될 때까지 경질을 통해 복부 피펫을 진행합니다.
11. 피펫 팁과 기준 와이어 사이에 기록 된 증폭 된 전압의 오디오 모니터에 이벤트를 급상승에 대한 들으면서 천천히 피펫을 진행합니다. 한 번 요동 치고 이벤트를 식별, 약 500 μV이 관찰 된 것보다 더 긍정적 인 것 전압 처짐까지 피펫 0 ~ 100 μm의 이동을 계속합니다.
    주 : 전극 저항은 약 1.5 ~ 10 (WH)의 인자에 의해 증가 할 것이다이 문제가 발생 갖추고 있습니다.
12. 일단 단위가 관심의 다른 모든 행동 및 생리 학적 측정과 함께, 3.11 단계에 따라로 고립 된 기록을 시작합니다. 본 데모에서는, 자체 생성 된 vibrissa 운동은 (자료 섹션 참조) 고속 비디오 그래피와 모니터링됩니다.
13. 기록 위치에 라벨을, 전극은 전류원에 연결하는 리드 스위치. , 내장 수동으로 현재 앰프에 소스, 또는 (그림 6D 단계를 참조 3.8 및 토론) - 중 릴레이 회로 (C 그림 6A)를 사용하여이 작업을 수행하는 여러 가지 방법이 있습니다. 합격 -4 μA를 50 % 듀티 사이클에서 2 초 펄스 4 분간 피펫을 통해 이온 삼투 시카고 스카이 블루를 주입.
14. 죽이고 표준 관행에 따라 여러 라벨링 절차 후 동물을 관류. 제 필요에 따라 뇌와 Counterstain과는 기록의 해부학 적 위치가 앉아 식별전자. ^(14)에 따라 시토크롬 산화 효소의 반응성에 대한 조직을 Counterstain과. 대안 적으로, 형광 현미경을 이용하여 시카고 스카이 블루 침전물을 식별.
    참고 : 정확하게 라벨 사이의 피펫을 언 클램프없이, 그것은 모든 라벨은 같은 날 같은 피펫으로 만든 것이 중요하다 다른 레이블 단위 구분하기 위해. 이 경우 기록 사이트는 각 사이트의 언급 조작하는 좌표와 함께 사후 조직학의 상대적 위치에 의해 구별 될 수있다 (단계 3.9 참조). 명확한 식별을 위해, 서로, 및 뇌 영역 당 최대 3-5 레이블에서 적어도 200 ㎛의 간격을 표시 라벨.

결과

쥐가 적극적으로 쫓기대로 vibrissa 운동의 위상 자체 생성이 ^{15, 16} 쫓기 동안 인코딩 시상 복부 후방 내측 (VPM)의 신경 단위. 그림 7a는 VPM 시상 단위의 샘플 스파이크 활동을 보여줍니다. 그림 7b는 스파이크의 히스토그램을 보여줍니다 시간 vibrissa 운동 ^(17)의 순시 위상 정렬. 쫓기의 후퇴 단계에서 더 스파이크가 있습니다. 도 7c에 도시 된 ?...

토론

실험 지그의 건설

이 다양한 방법으로 구성 될 수있는 지그 실험 (도 4)를 구축하는 데 사용되는 기계 부품의 설명은 생략 프로토콜. 이 데모 표준에서 광학 기계 부품 및 지원 클램프 헤드 구속 바, 신체 구속 튜브 (자료 섹션 참조) 마운트하는 데 사용됩니다. 유사 광학 기계식 전동 부를 미세 조작기에 전극 홀더를 장착하는데...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063