Uyarı, Baş-ölçülü Sıçanların Alt-kortikal Beyin Yapıları içinde Juxtacellular İzleme ve Yerelleştirme Single Nöronlar

Özet

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Özet

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Giriş

Aktif bir davranış görev yapan bir uyarı hayvanda nöronal aktivitenin izlenmesi sinir sisteminin fonksiyonunu ve organizasyonunu anlamak için önemlidir. Tek nöronal birimlerinden gelen elektriksel aktivite Hücre dışı kayıt uzun sistemleri nörobilim bir elyaf araç olmuştur ve şu anda kullanımda yaygın hala gelmiştir. Elektrot türleri ve yapılandırmaları çeşitli özel bir deney bilimsel ve teknik taleplerine bağlı olarak mevcuttur. Kronik mikro sürücü implante veya elektrot dizileri genellikle kuşlar, kemirgenler ve insan olmayan primatlar ^1-4 de dahil olmak üzere serbest hareket eden hayvanlar, kullanılır. Alternatif olarak, harici bir mikromanipülatör yoluyla, metal veya cam Mikroelektronlar akut girmeler genellikle anestezi veya kafa ölçülü hayvanlardan kaydetmek için kullanılır. Cam mikropipet elektrotlar juxtacellular kullanılan ya da "hücre bağlı" gibi bir avantajı vardır yapılandırma açıkça izole etmek için⁵ sıralama post-hoc başak komplikasyon olmadan tek nöronların aktivitesi. Onlar boya veya Nöroanatomik izleyiciler küçük mevduat enjekte, hatta tek bir hücre kaydedildi doldurmak için kullanılabilir gibi Bu elektrotlar daha, anatomik tanımlanan hücreleri veya konumlardan kayıt izin. Bu yapılandırma, başarılı bir fare, sıçan ve kuşlar ^6-10 uygulanmıştır. Şu anda açıklanan teknik juxtacellular izleme ve uyarı hücre dışı boya mevduat, baş-ölçülü fareler üzerinde duruluyor. Bu boya mevduat hücre morfolojisi veya aksonal projeksiyonlar ¹¹ hakkında bilgi vermemektedir doldurur juxtacellular ki aksine tek hücre Not, ancak uyarı hayvanlarda önemli ölçüde daha yüksek verime sahip, eleştirel, yaklaşık 50 um kesin anatomik lokalizasyon etkinleştirin ve. Yine anatomik etiketlenmesi için alternatif bir strateji olarak sağlanır doldurur juxtacellular tek hücre ile ilgili bilgiler.

Kısaca,protokol üç ana aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, sıçan 6 günlük bir süre boyunca bir bez çorap (Şekil 1) vücut kısıtlama alıştırıldı edilir. İkinci aşamada ise, bir kafalık cihazı (Şekil 2) ve kayıt odası cerrahi sıçan birden sonraki kayıt seansları (Şekil 3) sırasında sterotaksik düzlemde muhafaza edilebilir şekilde implante edilir; Bu prosedür, standart referans ¹² koordinatları dayalı elektrofizyolojik çalışma için beynin belirli alt-kortikal bölgeleri hedef deneyci sağlar. Üçüncü aşama açıkça tek birimleri ^6-9 izole juxtacellular nöronal kayıtları, (Şekil 5) kuvars kılcal tüpten elektrot inşa, davranışsal ve elektrofizyolojik deneyleri (Şekil 4) yürütmek yapmak için uygun bir jig sıçan yerleştirerek içerir ve anatomik Locati işaretlemeChicago Sky Blue boya (Şekiller 6 ve 7) ile kayıt site üzerinde. kayıtlar eş zamanlı davranışsal izleme ile yapılır; Bununla birlikte, davranış teknik detayları Her deney bilimsel hedeflerine bağlı olacak ve tek bir protokol kapsamı dışında kalırlar. Birden fazla gün tekrar edilebilir deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, hayvan kurban edilir. Beyin parlak alan veya floresan mikroskobu kullanarak standart nöroanatomik tekniklere göre ayıklanır ve işlenir.

Protokol

Federal reçete hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak - (350 gr 250) ve Kaliforniya San Diego Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi Deneysel protokoller dişi Long Evans fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir.

1. Vücut Kısıtlama için Rat acclimating

NOT: Bir kısıtlı diyet sıçan yerleştirin. Kısıtlama (aşağıda açıklanmıştır) sıçan gelmesini hemen her gün kullanım seansından sonra günde bir kez sıçan besleyin. Ilk ağırlığının% 80 hayvan korumak için yeterli yem sağlayın. Bu miktar 250 g ağırlığında dişi Long Evans fare için günlük besleme bölgesinin yaklaşık 6 gramdır.

1. Insanlar tarafından işlenen sıçan alıştırıldı. Yavaşça yaklaşık 5 saniye her 30 sn süre için elle sıçan dizginlemek. 2 gün üst üste 15 dakika bir gün için bunu yapın. Eğitim süresince stres belirtileri günlük sıçan izleyin. İşaretler i mücadele dahilkısıtlama, seslendirme ve diş gevezelik n yanıtı.
2. ^3. günde, 15 dakika, iki arka arkaya günde bir, günde bir vücuda sınırlayıcı kumaş çorap (Şekil 1), sıçan yerleştirin.
3. 5 ^inci gününde, çorap içine sıçan yerleştirin ve deneysel jig üzerine sert bir tüp (Şekil 4) içine çorap yerleştirin. 2 ardışık günde 15 dakika günde boru sıçan bırakın.
4. Her antrenmandan hemen sonra sıçan besleyin. Son oturumda ^(6. gün) sonunda gıda sınırsız erişim sağlar. Implantasyon için son eğitim gününde aşırı stres belirtileri göstermeye yok sadece bu sıçan seçin.
   NOT: implantasyon için sıçanların seçimi bizim elimizde, subjektif olmasına rağmen sıçanların% 90'ın üzerinde bağımlılığına duyarlı ve implantasyonu geçmesi mümkün bulundu.

2. Kayıt Odası ve Baş-kısıtlama Mekanizması implante

1. Bir yeniden yapınBir pin konnektörüne çıplak paslanmaz çelik tel lehim teli fark olmamas. 3-5 mm kalıntıları pin tarafından ortaya böylece tel kesin. Tüm cerrahi aletler ile birlikte, referans tel otoklavlayın.
2. Ketamin / ksilizin anestezi yönetme. 95 mg / intraperitoneal / kg ksilizin 5 mg ile karışık kg ketamin yönetme. başlangıç ​​dozu 1 ½ 2 saat boyunca devam eder. Gerektiği gibi, her 30-45 dk sonra anestezi Supplement. Bir göz merhem ile hayvanın gözlerini yağlayın.
3. Anestezi uçağı belirlemek ve gerekli anestezi korumak için ayak çekme refleksini kontrol edin.
4. Kulak çubukları ile bir stereotaksik tutma çerçeve içinde sıçan yerleştirin (Şekil 3A). Kafasına saç tıraş ve povidon-iyot (% 10 solüsyon) ile yara sitesi dezenfekte edin. Onlar kulak zarını zarar vermez, böylece uygun kulak çubukları eklemek için özen gösterin. Künt uçlu kulak çubukları tercih edilir.
5. Bir neşter Yaklafl bir kesi yapmakk kulak arkasına gözlerin postero-kaudal düzeyden kafatası orta hat boyunca. Kesme ve kesiğin iki tarafında bir deri 2-3 mm'lik şeridinin çıkarılması için makas kullanın.
6. Yanal sırtlara dışarı kafatası yüzeyini açığa çıkarmak için periost kazınması. Superglue ince bir tabaka ile maruz kafatası örtün.
7. ½ mm çaplı matkap çapak kullanarak, 0-80 vida biraz daha küçük çaplı, küçük bir delik delin (Malzeme bölümüne bakınız). Vida alt daha yanal üst gitmek böylece delik hemen Bregma dikiş yanal sırt karşılar, ve kafatası içine 30-45 ° açıyla yere posterior Matkap.
8. 30-45 ° açıyla, delik (yaklaşık 3 tur) bir 0-80 düz taban makine vida vidalayın. Altta yatan beyin dokusu zarar vermemek için çok derin bir vida için dikkatli olun.
9. Gösterilen konfigürasyonda 6 ek vidalar için bu işlemi tekrarlayın (Şekil 3B). Tüm vidalar tabanına superglue uygulayın.
10. Stereotaksi manipülatör bir şırınga iğnesi yerleştirin. Bir referans işareti olarak, istenen kraniotomi konumu Bregma dikiş itibaren ölçün ve yakın iğne ile kafatası bir göçük yapmak, ama dışarıda.
    NOT: Bu gösteri, markanın stereotaksik koordinatları 3 mm arka ve Bregma dikiş lateral 1 mm.
11. Kalıcı bir kalem ile göçük işaretleyin. Bir stereotaksik referans noktası olarak hizmet verecek gibi, marka stereotaksik koordinatlarını Not (Şekil 3B).
12. İstenen koordinatları (3 mm posterior ve bu örnekte bregma yanal 3 mm) üzerinde merkezlenmiş bir kranyotomi yapın. Sağlam dura mater bırakın. Tadil edilmiş yapay beyin omurilik sıvısı kraniyotomi Kapak (125 mM NaCI, 10 mM glukoz, 10 mM HEPES, 3.1 mM _CaCl2, 1.3 mM _MgCl2, pH 7.4) içinde ¹³ (Şekil 3C).
13. 4 0.2 ml santrifüj tüp Cut - uzunluğu 5 mm, ve kapağı kesti. Kafatası üzerinde tüp yerleştirin ve Kraniotomi üzerine merkezi.
14. Kafatasına tüpün tabanını mühürlemek için tüpün alt etrafında diş çimento uygulayın. Maruz Kraniotomi (Şekil 3D) içine çimento sızıntı dikkatli olun.
15. Kontralateral kranial plaka başka bir küçük delik (yaklaşık ½ mm çapında) delin ve dikkatle referans teli takın. (Donatımı bölümüne bakınız) telin ucuna kayıt amplifikatör ile arabirimleri bir iğne lehim teli referans Construct. Referans tel hareket etmeyin bu neden olabileceği hasar olarak beyinde bir kez.
16. Tel sokulduğu bir delik superglue uygulanır. Bu geçici bir yerde pin ve tel mühür olacaktır.
17. Silikon jel kitinin iki parça karıştırın yaklaşık olarak eşit kısımlar halinde (Malzemeler kısmına bakınız). Karıştırma ve fil için iki dakika bekleyinl santrifüj tüpü yaklaşık ⅓ jel ile dolu.
18. Bir dik açı sonrası kelepçesini takın kafalık çubuğuna (Malzeme bölümüne bakınız). Plaka alt hayvanın burun doğru olduğunu böylece 45 ° eğim açısında tutma çubuğunun (Şekil 2B) kafa plakasını (Şekil 2A) takın. Bu deneysel jig (Şekil 4) uyacak şekilde pitch açısını ayarlamak için bir eğimölçere kullanmak yararlı olur.
19. Bar kulak çubukları paralel olacak şekilde stereotaksi manipülatör koluna tutma çubuğunu takın. Plaka kaudal-en vidasına lambda dikiş ve ön arka böylece bar ve plaka indirin.
20. Ön kafa cıvata kavrayın (bir 8-32 damızlık veya vida, Malzeme bölümüne bakınız) vidanın baş aşağı ve hayvan kuyruk doğru bakacak şekilde, bir yardım eller kol ve kelepçe ile yaklaşık 45 ° 'lik açıyla. O karınca değecek şekilde vidayı indirinerior 0-80 vida (Şekil 3F, G).
21. Diş akrilik ile yerde cıvata ve plaka sabitleyin. Kemik vida başlarının etrafında diş akrilik, referans pimini uygulayın ve santrifüj tüpünün yüzüne etrafında. Diş akrilik kuruması için yaklaşık 10 dakika bekleyin (Şekil 3H).
22. Implanta cilt çimentolama, diş akrilik kenarlarında diş çimento tabakası uygulayın. Çimento kurumasını bekleyin.
23. Santrifüj tüpünün kapağı birkaç delik karıştırmak ve tüp kapağını yerleştirin.
24. Yardım eller kelepçe çıkarın. Sonra dikkatlice stereotaksi kafa tutan çubuğunu kaldırmak ve daha sonra bar (Şekil 3I) kafa plaka kaldırmak.
25. Stereotaksi hayvan çıkarın ve yürürlükteki tüm kurallar, yönetmelikler, kanunlar ve (uygun post-operatif bakım ve izleme yönetmek, örneğin, Buprenorfin 0.02 mg / kg, 24 en az her 8-12 saatsaat). Inflamasyon implant kenarlarında oluşursa çözülene kadar, günlük etkilenen site antibiyotik merhem ince bir tabaka uygulayın.

Nöronal Birimleri 3. Juxtacellular İzleme

1. Bir karbondioksit lazer mikropipet çektirmesi üzerine kuvars kılcal boru çekin az 1 mikron (Şekil 5A) ucu çapları (Ekipman bölümüne bakınız).
   NOT: ısıtma parametreler arasında özellikle araca göre değişecektir ve gerekli olan boyun çapının ilgi beyin yapısına bağlı olarak değişecektir ki. Sıçan talamus kayıtları için, mikropipetler 5-7 mm arasında değişen boyunları var.
2. Uzun çalışma mesafesi hedefleri ile donatılmış bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskop altında yerine pipet sabitleyin. Mikroskop sahnede yerinde pipet tutmak için modelleme kil kullanın.
3. Mak için kullanılan bir cam parçası, 1 cm kalınlığında - Yavaşça 0.5 cam bloğu (hareketUltra-mikrotom bıçak ing pipet ile görüş alanı içine) uygundur. Sahne mikromanipülatör kullanarak, yavaşça kırmaya neden cama pipet dokunun. Pipet dış çapı 1-3 mikron arasında olana kadar gerekli tekrarlayın (Şekil 5B, C). Bu mikropipetler yaklaşık 5-15 MΩ arasındaki empedanslara sahip olduğundan emin olun.
4. Hücre-dışı tuzlu su (135 mM NaCI, 5.4 mM KCI, 1.8 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, NaOH ile 5 mM HEPES, pH 7.2) ile ⁸ Hazırlama Chicago Sky Blue (ağ / hac)% 2 ekleyin. 30 G iğne ya da daha küçük olan bir şırınga kullanılarak, çözelti ile pipet arka uç doldurun. Seçenek olarak ise, tek bir hücre juxtacellular etiketleme için% 2 ilave (ağırlık / hacim) neurobiotin da biyotinile edilmiş dekstran amin (BDA-3000 ya da BDA-10000) ve Chicago Sky Blue yerine tuzlu su çözeltisine ilave edilir.
5. Uygun bir deneysel jig üzerinde sert tüp içinde bez çorap içine sıçan yerleştirin ( Şekil 4) .Wait kafa tutma jig üzerinde hayvan yerleştirmeden önce ameliyat sonrası 72 saat en az. Havayolu tıkanıklığı önlemek için, yerine boyun daha üst sternum etrafında İpli sıkın. Solunum zorlanarak veya tıkalı gibi görünüyorsa, İpli gevşetin veya posterior taşıyın. Sıçan uyarı ise bu yordamı uygulayın.
6. Jig karşılık gelen parça sıçan baş-frenleyici plaka takın. Bunu yapmak için, ilk etapta baş kısıtlama plaka pin ve daha sonra bir 4-40 vida kullanarak sabitleyin. Hayvan başına aşırı tork uygulayarak önlemek için sakin beklemek emin olun. Sonraki sıçan implante edilir kafa frenleyici cıvata somunu bir 8-32 yerleştirin. Sonra baş cıvata dişli paslanmaz çelik çubuk vida. Yerine sıkılabilecek bir şekilde (Şekil 4) 'de deneysel jig çubuğun yapıştırın.
   NOT: Baş-kısıtlama plaka min yanı sıra baş cıvata ile hayvan güvenliğinidüzeneğin bükme imizes ve kayıt kararlılığını geliştirir. İlk gün başlayabilir kayıt Çoğu durumda hayvan kafa ölçülü olduğunu. Hayvan aşırı kıpırdıyor veya seslendirir Ancak, herhangi bir kayıtları başlamadan önce baş-emniyet alışma eğitimi bir gün sunmak. Bu durumda, 15 dakika boyunca şablon üzerine hayvan bırakın ve daha sonra kafes içinde geri koyun. Ertesi gün bu adımı tekrarlayın ve protokol ile devam edin.
7. Kayıt odasına açın ve silikon jel çıkarın. Doku Kraniotomi yeniden büyüdü eğer ince forseps kullanarak kraniotomiye temizleyin.
8. Motorlu mikromanipülatör pipet takın ve headstage öncesi amplifikatör takın.
   NOT: Bu gösteride, headstage küçük bir röle devresi amplifikatör kurşun teller ve yüksek uyum (Şekil 6A-C) ile harici akım kaynağı arasında geçiş yapmak için kullanılır. Bazı amplifikatörler yerleşik bir uygun en yüksek uyum kaynağı olduğunu unutmayın(Tartışma ve Malzeme bölümlerine bakınız).
9. Kayıt odasında stereotaxically tespit işareti pipet ucu taşımak için motorlu mikromanipülatör kullanın. Bu konumun koordinatlarını unutmayın. Kafatası üzerinde pipet ucu kırmak için değil dikkatli olun.
10. Ön-arka ve iç-dış eksende istenilen kayıt konuma pipet taşıyın. Amaçlanan kayıt konumuna yaklaşık 500 mikron dorsal kadar Sonra dura ile ventral pipet ilerlemek.
11. Pipet ve referans tel arasında kaydedilen güçlendirilmiş gerilim bir ses monitörde olayları spike için dinlerken yavaşça pipet ilerlemek. Bir kez spiking olaylar tespit edilir, yaklaşık 500 mV gözlenir daha fazla pozitif gidiş gerilim sapması kadar pipet 0-100 mikron hareket devam ediyor.
    NOT: elektrot direnci yaklaşık 1,5-10 wh bir faktör artacakBu durumda en.
12. Bir kez birim ilgi tüm diğer davranışsal ve fizyolojik önlemlerle birlikte, 3.11 adıma göre izole edilmiş kayıt başlayın. Bu gösteride, kendi ürettiği bıyık hareketleri (Malzeme bölümüne bakınız) yüksek hızda videografi ile izlenmektedir.
13. Kayıt siteyi etiketlemek için, elektrot akım kaynağına bağlanmak yol açar geçiş. , Yerleşik bir el mevcut amplifikatör kaynağı, ya da (Şekil 6D, bkz adım 3.8 ve Tartışma) - ya bir röle devresi (C Şekil 6A) kullanarak bunu yapmak için birkaç yolu vardır. Geçiş -4 uA% 50 işlem devirinde 2 sn darbeleri ile 4 dakika boyunca iyontoferik pipet ile Chicago Sky Blue enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir.
14. Öldürmek ve standart uygulamaya göre çeşitli etiketleme prosedürlerinden sonra hayvan serpmek. Bölüm olarak gerekli beyin ve counterstain kayıt anatomik konumu oturup tanımlamak içinör. ¹⁴ uyarınca sitokrom oksidaz reaktiflik için doku Counterstain. Alternatif olarak, floresan mikroskobu kullanarak Chicago Sky Blue mevduat tespit.
    NOT: doğru etiketler arasında pipet çözülmesini olmadan, tüm etiketler aynı gün aynı pipet ile yapılır önemlidir farklı etiketli birimler ayırt etmek. Bu durumda kayıt siteleri her sitenin kaydetti manipülatör koordinatları ile birlikte post-hoc histoloji onların göreceli konumlara göre ayırt edilebilir (adım 3.9 bakınız). Kesin tanımlama için, birbirlerine ve beyin bölgelere göre en fazla 3-5 etiket en az 200 mikron dışında etiketleri işaretleyin.

Sonuçlar

Bir sıçan aktif çırpma gibi bıyık hareketinin faz kendi ürettiği ^15,16 çırpma esnasında kodlamak talamus ventral posterior medial (VPM) nöronal birimler. Şekil 7A bir VPM talamik birimin örnek spike aktivitesini gösterir. Şekil 7B başak bir histogram gösterir Zaman bıyık hareket ¹⁷ anlık aşamasına hizada. Çırpma geri çekilme aşamasında daha fazla sivri vardır. Şekil 7C'de gösterildiği gibi Kayıttan sonra, ...

Tartışmalar

Deneysel jig İnşaatı

Bu çeşitli şekillerde imal edilebilir deney jig (Şekil 4) oluşturmak için kullanılan mekanik parçaların açıklaması protokol atlandı. Bu gösteri standardında opto-mekanik parça ve destek kelepçeler kafalık bar ve vücut kısıtlama tüp (Malzeme bölümüne bakınız) monte etmek için kullanılır. Benzer opto-mekanik parçalar motorlu mikromanipülatör elektrot tutucu monte etmek içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063