Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

Riepilogo

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Abstract

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Introduzione

Monitoraggio attività neuronale in un animale avviso attivamente impegnato in un compito comportamentale è fondamentale per comprendere la funzione e l'organizzazione del sistema nervoso. Registrazione extracellulare dell'attività elettrica dalle unità neuronali singole è stato a lungo uno strumento fiocco di sistemi neuroscienze ed è ancora ampiamente in uso al momento. Una varietà di tipi di elettrodi e configurazioni sono disponibili a seconda delle esigenze scientifiche e tecniche di un particolare esperimento. Cronicamente impiantati microdrive o schiere di elettrodi vengono spesso utilizzati in animali liberi di muoversi, compresi gli uccelli, roditori e primati non umani ^1-4. In alternativa, penetrazioni acuti di metallo o di vetro microelettrodi tramite un micromanipolatore esterna sono spesso utilizzati per registrare da animali anestetizzati o testa-trattenuto. Elettrodi micropipetta di vetro hanno il vantaggio che possono essere utilizzati nel juxtacellular o "cellule attaccate" configurazione per isolare l'ambiguitàattività dei neuroni singoli senza le complicazioni di picco post-hoc di ordinamento ^5. Questi elettrodi consentono ulteriori registrazioni da cellule o posizioni anatomicamente identificati, in quanto possono essere utilizzati per iniettare piccoli depositi di tintura o neuroanatomici traccianti, o anche per riempire l'individuo registrato cella. Questa configurazione è stata applicata con successo in ratti, topi e uccelli ^6-10. La tecnica attualmente descritta si concentra sul monitoraggio juxtacellular e depositi tintura extracellulari in allerta, ratti testa-trattenuto. Si noti che a differenza di singola cellula juxtacellular riempie, questi depositi di colorante non forniscono informazioni sulla morfologia cellulare o proiezioni assonale ^11, ma consentire la localizzazione anatomica esatta a circa 50 micron e, criticamente, hanno un rendimento significativamente più alto in allarme animali. Informazioni riguardanti unicellulare juxtacellular riempie viene comunque fornito come una strategia alternativa per l'etichettatura anatomica.

In breve, laprotocollo consiste di tre fasi principali. Nella prima fase, il ratto è acclimatati per contenzione corpo in un calzino stoffa (Figura 1) in un periodo di 6 giorni. Nella seconda fase, un apparato poggiatesta (Figura 2) e la camera di registrazione vengono impiantati chirurgicamente tale che il topo può essere mantenuta nel piano stereotassico durante più sessioni di registrazione successivi (Figura 3); questa procedura consente lo sperimentatore di mirare determinati regioni sub-corticali del cervello per lo studio elettrofisiologico in base a coordinate di riferimento standard ^12. La terza fase prevede il posizionamento del ratto in una maschera appropriato per effettuare gli esperimenti comportamentali ed elettrofisiologici (Figura 4), ​​costruendo l'elettrodo da un tubo di quarzo capillare (figura 5), effettuare registrazioni neuronali juxtacellular che inequivocabilmente isolano singole unità ^6-9, e segnando i locati anatomicisul sito di registrazione con Chicago Sky colorante blu (figure 6 e 7). Le registrazioni sono eseguite con monitoraggio comportamentale simultanea; tuttavia, i dettagli tecnici del comportamento dipenderanno gli obiettivi scientifici di ogni esperimento e sono quindi oltre la portata di un unico protocollo. Dopo il completamento della procedura sperimentale, che può essere ripetuta più giorni, l'animale è eutanasia. Il cervello viene estratto e lavorato secondo le tecniche neuroanatomiche standard utilizzando sia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza.

Protocollo

Sono stati effettuati i protocolli sperimentali su ratti femmine lungo Evans (250-350 g) in conformità alle linee guida per la cura degli animali e uso federale prescritti e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università della California a San Diego.

1. acclimatare il Ratto di Corpo Restraint

NOTA: Posizionare il ratto su una dieta ristretta. Alimentare il topo una volta al giorno immediatamente dopo ogni sessione di trattamento al giorno per ambientarsi il ratto al sistema di ritenuta (descritto di seguito). Fornire abbastanza alimentazione per mantenere l'animale al 80% del suo peso iniziale. Tale importo è di circa 6 grammi di mangime al giorno per 250 g femminile di lunga Evans ratto.

1. Acclimatare il ratto di essere manipolati da esseri umani. Frenare delicatamente il ratto a mano per periodi di circa 5 sec ogni 30 sec. Fate questo per 15 minuti al giorno su 2 giorni consecutivi. Monitorare i ratti al giorno per i segni di stress durante il periodo di formazione. Segni includono lottando iRisposta n a moderazione, la vocalizzazione, e denti chattering.
2. Al 3 ^° giorno, collocare il ratto in un panno calzino-limitante corpo (Figura 1) per 15 minuti al giorno per due giorni consecutivi.
3. Al 5 ^° giorno, posizionare il ratto all'interno della calza, e posizionare il calzino all'interno di un tubo rigido sulla maschera sperimentale (Figura 4). Lasciare il ratto nel tubo per 15 min al giorno su 2 giorni consecutivi.
4. Concime subito il ratto dopo ogni sessione di allenamento. Al termine dell'ultima sessione (6 ^° giorno) darà accesso illimitato al cibo. Selezionare per l'impianto solo i topi che non presentano segni di stress eccessivo l'ultimo giorno di allenamento.
   NOTA: Sebbene selezione di ratti per l'impianto è soggettiva, nelle nostre mani oltre il 90% dei ratti sono stati trovati per essere sensibili alle assuefazione e in grado di subire l'impianto.

2. Impianto del meccanismo di camera di registrazione e poggiatesta

1. Fare un reconferenza filo da saldatura filo di acciaio inossidabile nudo a un connettore pin. Tagliare il filo in modo che resti 3-5 mm scoperti dal perno. Sterilizzare il filo di riferimento, insieme a tutti gli strumenti chirurgici.
2. Somministrare ketamina / xylazina anestesia. Somministrare 95 mg / kg ketamina mescolato con 5 mg / kg per via intraperitoneale xilazina. La dose iniziale dura 1½ a 2 ore. Supplemento anestesia ogni 30-45 minuti, successivamente, se necessario. Lubrificare occhi dell'animale con una pomata oftalmica.
3. Controllare il riflesso recesso punta per determinare il piano di anestesia, e mantenere l'anestesia, se necessario.
4. Posizionare il topo in una cornice di partecipazione stereotassico con barre orecchio (Figura 3A). Radersi i capelli sulla testa e disinfettare la ferita con povidone-iodio (soluzione al 10%). Fare attenzione a inserire le barre di orecchio in modo appropriato in modo che non danneggino il timpano. Barre di orecchio con punte smussate sono preferibili.
5. Praticare un'incisione con un approxi bisturinell'intervallo lungo la linea mediana del cranio dal livello rostro-caudale degli occhi alla parte posteriore delle orecchie. Utilizzare forbici per tagliare e rimuovere una striscia di 2-3 mm di cute su entrambi i lati dell'incisione.
6. Raschiare periostio per esporre la superficie del cranio verso le creste laterali. Coprire il cranio esposta con sottile strato di colla.
7. Praticare un piccolo foro con un diametro leggermente inferiore rispetto 0-80 viti, utilizzando un trapano bava ½ mm di diametro (vedi sezione Materiali). Praticare il foro posteriormente immediatamente a dove la sutura bregma incontra la cresta laterale, e con un angolo di 30-45 ° nel cranio, in modo che la vite può andare a cima più laterale rispetto al fondo.
8. Avvitare una vite 0-80 macchina a fondo piatto al foro (circa 3 giri), a 30-45 °. Fare attenzione a non avvitare troppo profondamente per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale sottostante.
9. Ripetere questa procedura per 6 viti supplementari nella configurazione mostrata (Figura 3B). Applicare colla alla base di tutte le viti.
10. Inserire un ago della siringa nel manipolatore stereotax. Misurare dalla sutura bregma, e fare un'ammaccatura nel cranio con l'ago vicino, ma al di fuori del luogo craniotomia desiderata, come un marchio di riferimento.
    NOTA: In questa dimostrazione, le coordinate stereotassica del marchio sono di 3 mm posteriori e 1 mm laterali alla sutura bregma.
11. Segna il dente con un pennarello indelebile. Nota le coordinate stereotassica del marchio, in quanto servirà come punto di riferimento stereotassico (Figura 3B).
12. Fare una craniotomia centrato sulle coordinate desiderate (da 3 mm posteriormente e 3 mm laterali bregma in questo esempio). Lasciare la dura madre intatto. Coprire la craniotomia con liquido cerebro-spinale artificiale modificato (125 mM NaCl, il glucosio 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM CaCl _2, 1.3 mM MgCl _2, pH 7.4) ¹³ (Figura 3C).
13. Tagliare un tubo di 0,2 ml centrifuga a 4 - 5 mm di lunghezza, e tagliare il tappo. Posizionare il tubo sul cranio e centrare la craniotomia.
14. Applicare cemento dentale intorno alla parte inferiore del tubo per sigillare la base del tubo al cranio. Fare attenzione a non far trapelare il cemento in craniotomia esposta (Figura 3D).
15. Praticare un piccolo foro (circa ½ mm di diametro) nella piastra cranica controlaterale e inserire delicatamente il filo di riferimento. Costruire il filo di riferimento saldando un perno che si interfaccia con l'amplificatore registrazione alla fine del filo (vedi sezione Equipment). Non spostare il cavo di riferimento una volta che è nel cervello in quanto ciò potrebbe causare danni.
16. Applicare colla al foro in cui è stato inserito il filo. Questo sigillare il perno e il filo in luogo temporaneamente.
17. Mescolare le due parti del kit gel di silicone (vedere la sezione Materiali) in porzioni di circa uguali. Attendere due minuti per la miscelazione e fill provetta di circa ⅓ completo con il gel.
18. Fissare un diritto pinza angolare posta (vedere la sezione Materiali) alla barra di poggiatesta. Fissare la piastra di testa (figura 2A) per la barra di tenuta (Figura 2B) con un angolo di passo di 45 ° in modo che la parte inferiore della piastra sia verso il naso dell'animale. È utile utilizzare un inclinometro per impostare l'angolo di inclinazione corrispondente a quello della dima sperimentale (Figura 4).
19. Fissare la barra di tenuta al braccio stereotax manipolatore in modo che la barra sia parallela alle barre orecchio. Abbassare la barra e la piastra in modo che la piastra è posteriore della sutura lambda e anteriore al caudale più a vite.
20. Afferrare la testa bullone anteriore (a 8-32 perno o vite, vedere la sezione Materiali) a circa 45 ° con una mano aiutando braccio e pinza, in modo che la testa della vite rivolto verso il basso e verso la coda dell'animale. Abbassare la vite in modo che tocchi la formicaerior 0-80 viti (Figura 3F, G).
21. Fissare il bullone e la piastra in posizione con acrilico dentale. Applicare acrilico dentale attorno alle teste delle viti dell'osso, perno di riferimento, e intorno ai lati del tubo da centrifuga. Attendere circa 10 minuti per l'acrilico dentale asciugare (Figura 3H).
22. Applicare uno strato di cemento dentale attorno ai bordi del acrilico dentale, cementando la pelle per l'impianto. Attendere che il cemento si asciughi.
23. Poke diversi fori nel tappo della provetta, e posizionare il tappo sul tubo.
24. Rimuovere la fascetta mani aiutare. Quindi rimuovere con attenzione la barra testa-holding dalla stereotax, e quindi rimuovere la piastra testa dalla barra (Figura 3I).
25. Rimuovere l'animale dal stereotax e amministrare cure post-operatorie e il monitoraggio in conformità con tutte le norme, i regolamenti e le leggi (ad esempio, Buprenorfina 0,02 mg / kg, ogni 8-12 ore per un minimo di 24hr). Se l'infiammazione si sviluppa intorno ai bordi della protesi, applicare uno strato sottile di unguento antibiotico al sito interessato giorni fino risolto.

3. Juxtacellular monitoraggio delle unità neuronali

1. Tirare il tubo capillare di quarzo su un anidride carbonica micropipetta laser estrattore (vedi sezione Equipment) con diametro di punta di meno di 1 micron (Figura 5A).
   NOTA: i parametri di riscaldamento variano a seconda del particolare strumento, e che il diametro del collo richiesto varierà a seconda della struttura cerebrale di interesse. Per le registrazioni nel ratto talamo, micropipette sono colli che vanno da 5-7 mm.
2. Fissare la pipetta in luogo sotto un contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio equipaggiato con obiettivi distanza di lavoro. Utilizzare plastilina per tenere la pipetta in posizione sul palco del microscopio.
3. Lentamente spostare un blocco di vetro (0,5 - 1 cm di spessore, un pezzo di vetro usato per making coltelli ultra-microtomo è conveniente) nel campo visivo, con la punta della pipetta. Utilizzando il micromanipolatore fase, toccare delicatamente la punta della pipetta di vetro, provocando la rottura. Ripetere se necessario fino a quando il diametro esterno punta della pipetta è tra 1-3 micron (Figura 5B, C). Assicurarsi che questi micropipette hanno impedenze tra circa 5-15 MW.
4. Preparare salina extracellulare (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 5 mM HEPES, pH 7,2 con NaOH) ⁸ e aggiungere 2% (w / v) Chicago Sky blu. Usando una siringa con un ago 30 G o minore, riempire la estremità posteriore della pipetta con la soluzione. In alternativa, per singola cellula etichettatura juxtacellular aggiungere 2% (w / v) Neurobiotin o biotinilato ammina destrano (BDA-3000 o BDA-10000) alla soluzione salina al posto di Chicago Sky blu.
5. Posizionare il topo all'interno della calza panno all'interno del tubo rigido in adeguato maschera sperimentale ( Figura 4) .Wait un minimo di 72 ore dopo l'intervento chirurgico prima di mettere l'animale in maschera poggiatesta. Stringere la coulisse intorno sterno superiore, piuttosto che il collo, per evitare l'ostruzione delle vie aeree. Se la respirazione sembra essere lavorato o ostacolato, allentare la coulisse o spostarlo posteriormente. Effettuare questa procedura, mentre il topo è vigile.
6. Fissare la piastra di testa di ritenuta sul ratto al pezzo corrispondente sulla maschera. Per fare questo, prima pin la piastra poggiatesta in luogo, e poi fissarlo con una vite 4-40. Ricordarsi di aspettare fino a quando l'animale è calma per evitare di applicare una coppia eccessiva alla testa. Successivamente, posizionare un 8-32 dado sul bullone testa frenare che viene impiantato nel topo. Quindi avvitare in un tondino di acciaio inossidabile filettato per la testa del bullone. Fissare l'asta alla maschera sperimentale in modo tale che possa essere serrato in posizione (figura 4).
   NOTA: Protezione animale con testa del bullone e la piastra poggiatesta minimizes piegatura dell'apparato e migliora la stabilità di registrazione. Nella maggior parte dei casi la registrazione può iniziare il primo giorno l'animale è capo-trattenuto. Tuttavia, se l'animale si agita eccessivamente o vocalizza, fornire una giornata di formazione assuefazione poggiatesta prima di iniziare le registrazioni. In questo caso, l'animale lasciato sulla maschera per 15 min e poi riposizionarlo nella sua gabbia. Ripetere questo passaggio il giorno successivo e continuare con il protocollo.
7. Aprire la camera di registrazione e rimuovere il gel di silicone. Pulire la craniotomia utilizzando una pinza sottile se il tessuto è nuovamente cresciuta in craniotomia.
8. Fissare la pipetta al micromanipolatore motorizzato, e collegare il headstage pre-amplificatore.
   NOTA: Nel presente dimostrazione, un piccolo circuito relè sul headstage viene utilizzato per passare i cavi amplificatore e una sorgente di corrente esterna con alta compliance (Figura 6A-C). Si noti che alcuni amplificatori hanno un adeguato incasso sorgente ad alta compliance(Vedi la discussione e Materiali sezioni).
9. Utilizzare il micromanipolatore motorizzato per spostare la punta della pipetta a volume stereotaxically identificato nella camera di registrazione. Nota le coordinate di questa posizione. Fare attenzione a non rompere la punta della pipetta sul cranio.
10. Spostare la pipetta nella posizione di registrazione desiderata negli assi antero-posteriore e medio-laterale. Poi avanzare la pipetta ventrale attraverso la dura fino a quando non è di circa 500 micron dorsale nella posizione di registrazione prevista.
11. Lentamente avanzare la pipetta durante l'ascolto di chiodare eventi su un monitor audio della tensione amplificata registrata tra la punta della pipetta e il filo di riferimento. Una volta che gli eventi spiking sono identificati, continuano a spostare la pipetta 0-100 micron fino positive deviazioni di tensione in corso superiori si osservano circa 500 mV.
    NOTA: La resistenza dell'elettrodo aumenterà di un fattore di circa 1,5-10 when ciò si verifica.
12. Iniziare a registrare una volta una unità è stato isolato come secondo punto 3.11, insieme a tutte le altre misure comportamentali e fisiologici di interesse. Nel presente manifestazione, i movimenti delle vibrisse auto-generati sono monitorati con videografia ad alta velocità (vedere la sezione Materiali).
13. Per etichettare il sito di registrazione, passare l'elettrodo porta per la connessione al generatore di corrente. Ci sono diversi modi per farlo, utilizzando un circuito di relè (Figura 6A - C), dotato di un generatore di corrente dell'amplificatore, o manualmente (Figura 6D, vedere il punto 3.8 e discussione). Passare -4 μA con 2 impulsi sec al 50% duty cycle per 4 minuti di iniettare iontophoretically Chicago Blue Sky attraverso la pipetta.
14. Uccidere e profumato l'animale dopo diverse procedure di etichettatura secondo la prassi consueta. Sezione del cervello e di contrasto se necessario per identificare la posizione anatomica della registrazione sederee. Controcolorare il tessuto per la citocromo ossidasi reattività secondo ^14. In alternativa, individuare i depositi di Chicago Sky Blu usando la microscopia a fluorescenza.
    NOTA: Per distinguere con precisione tra le diverse unità etichettati, è importante che tutte le etichette sono realizzati con la stessa pipetta lo stesso giorno, senza che lo sbloccaggio la pipetta tra le etichette. In questo caso i siti di registrazione possono essere differenziati dai loro posizioni relative in istologia post-hoc insieme alle coordinate manipolatore noti di ogni sito (vedere il punto 3.9). Per l'identificazione univoca, contrassegnare le etichette di almeno 200 micron l'uno dall'altro, e non più di 3-5 etichette per regione del cervello.

Risultati

Unità neuronali in ventrale posteriore mediale (VPM) talamo codificare la fase di movimento vibrissa durante autogenerata sbattere ^15,16. Figura 7A mostra attività spiking del campione di un'unità talamica VPM come un topo è attivamente sbattere. Figura 7B mostra un istogramma di picco tempi allineati alla fase istantanea di vibrissa movimento ^17. Ci sono più picchi durante la fase di retrazione di sbattere. Dopo la registrazione, la posizione dell&#...

Discussione

Costruzione della maschera sperimentale

La descrizione delle parti meccaniche utilizzate per costruire la maschera sperimentale (Figura 4) viene omesso dal protocollo, in quanto può essere realizzato in una varietà di modi. In questo standard manifestazione sono utilizzati opto-meccaniche parti e morsetti di supporto per il montaggio del bar poggiatesta e il tubo di ritenuta corpo (vedere la sezione Materiali). Parti simili o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063