アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

要約

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

要約

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

概要

積極的に行動のタスクに従事し、アラート、動物における神経活動の監視は、神経系の機能と組織を理解するために重要です。シングルニューロンユニットからの電気的活動の細胞外記録は、長いシステム神経科学の定番ツールとなって、現在で使用されて広くまだいる。電極の種類とさまざまな構成は、特定の実験の科学的·技術的な要求に応じて利用可能です。慢性移植マイクロドライブまたは電極アレイは、多くの場合、鳥類、げっ歯類、非ヒト霊長類を含む^1-4、自由に動物を移動させる際に使用される。また、外部のマイクロマニピュレーターを経由して金属やガラス微小電極を伴う急性の貫通部は、多くの場合、麻酔をかけたり頭拘束動物から記録するために使用されます。ガラスマイクロピペット電極は、それらが明確に隔離するjuxtacellularまたは「細胞添付」構成で使用することができるという利点を有する^5ソート事後スパイクの合併症のない単一ニューロンの活動。これらは、色素または神経解剖学的トレーサーの小さな堆積物を注入するために、または個々のセルを記録充填するために使用することができるようにこれらの電極はさらに、解剖学的に同定された細胞または場所から記録を可能にする。この構成は、正常に、ラット、マウス、鳥類^6-10に適用されている。現在記載の技術は、juxtacellular監視や警告における細胞外の色素沈着、頭部拘束ラットに焦点を当てています。埋めjuxtacellular単一のセルとは異なり、これらの色素の沈着は細胞形態または軸索突起¹¹についての情報を提供していないが、彼 ​​らは約50μmの正確な解剖学的局在を有効にし、批判的に、アラートの動物では有意に高い収量を持っていることに注意してください。それにもかかわらず、解剖学的標識のための代替戦略として提供されて埋めjuxtacellular単一セルに関する情報。

要するに、プロトコルは3主要な段階で構成されています。第一段階では、ラットを6日間にわたって布靴下（ 図1）身体拘束に順応される。第2段階では、ヘッドレスト装置（ 図2）および記録チャンバーは、外科的に、ラットは、複数の次の記録セッション（ 図3）の間に定位面内に維持することができるように注入される。この手順は、標準的な参照が^12を座標に基づいて、電気生理学的研究のために、脳の特定のサブ皮質領域を標的とするように実験者が可能になります。第三相は、確実に1つのユニット^6-9を分離juxtacellularニューロンの記録を、（ 図5）石英キャピラリー管から電極を構成し、行動および電気生理学的実験（ 図4）を行って製造するための適切な治具にラットを配置することを含む、および解剖locatiマーキングシカゴスカイブルー色素（ 図6および7）と記録部位の上。録音は、同時行動の監視を行っている。しかし、行動の技術的な詳細は、各実験の科学的な目標に依存し、単一のプロトコルの範囲を超えてこのようにある。複数の日に繰り返すことができる実験手順の完了後、動物を安楽死させる。脳は、明視野または蛍光顕微鏡のいずれかを使用して、標準的な神経解剖技術に従って抽出され、処理される。

プロトコル

連邦政府が定める動物の管理と使用ガイドラインに従って - （350gの250）とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校で施設内動物管理使用委員会によって承認された実験的なプロトコルでは、女性のロングEvansラットで行った。

1.ボディ拘束へのラットを順応

注：制限食でラットを置きます。拘束（後述）にラットを順応さただちに各毎日の取り扱いセッションの後一日一回のラットを養う。その初期重量の80％で動物を維持するための十分な供給を提供する。この量は、250グラムのメスのロングエバンスラットのための一日あたりの飼料の約6グラムである。

1. 人間によって処理されることにラットを順応さ。ゆっくりと約5秒ごとに30秒の期間の手でラットを拘束。 2日連続で15分間日のためにこれを行います。訓練期間中のストレスの徴候について毎日ラットを監視します。兆候は苦労私を含む拘束、発声、および歯チャタリングn個の応答。
2. 3 ^日目には、2日連続で15分間、一日のために（ 図1）身体を拘束布靴下にラットを置く。
3. 5日^目に、靴下の中にラットを置き、実験的な治具（ 図4）に剛性管の内側に靴下を置く。 2日連続で15分間の日にチューブでラットのままにしておきます。
4. 各トレーニングセッションの直後にラットを養う。最後のセッション（6 ^日目 ）の終わりに、食品への無制限のアクセスを与える。移植のために最後の訓練の日に過度のストレスの兆候を示していないだけで、これらのラットを選択します。
   注：注入用ラットの選択は主観的であるが、我々の手で、ラットの90％以上が慣れに応じて、移植を受けることができることが見出された。

2.録音商工頭部拘束機構を注入

1. 再を作るピンコネクタに裸のステンレス鋼線を半田付けすることによりフェレンスワイヤー。 3〜5ミリメ​​ートルは、ピンによって発見されたままであるようにワイヤーをカット。すべての手術のツールと​​一緒に、参照線をオートクレーブ。
2. ケタミン/キシラジン麻酔を管理します。 95ミリグラム/腹腔内に5 mg / kgをキシラジンと混合kgのケタミンを管理します。初期投与量は1.5〜2時間持続する。必要に応じて、すべての30〜45分間、その後、麻酔を補足する。眼軟膏で動物の目に注油。
3. 麻酔の平面を決定するために、そのTOE引っ込め反射を確認し、必要に応じて麻酔を維持。
4. 耳バー付きの定位保持枠にラットを置きます （ 図3A）。頭の毛を剃るとポビドンヨード（10％溶液）で創傷部位を消毒する。彼らは鼓膜を損傷しないように適切に耳バーを挿入するように注意してください。鈍ヒントを耳バーが好ましい。
5. メスapproxiで切開するmately耳の後ろに目の吻側 - 尾側レベルから頭蓋の正中線に沿って。切開の両側の皮膚2-3 mmのストリップをカットし、削除するにはハサミを使用してください。
6. 横方向の尾根に出て頭蓋の表面を露出させる骨膜を削り取る。瞬間接着剤の薄層で暴露頭蓋をカバーしています。
7. ½直径ドリルバリ（ 材料の項を参照）を使用して、0〜80のネジよりもわずかに小さい直径で、小さな穴を開けます。ネジが下よりも横方向のトップで行くことができるように、ブレグマ縫合糸が横尾根を満たしている場所に後方、および30〜45°の角度で頭蓋にすぐに穴を開けます。
8. 30〜45°の角度で、穴（約3回転）に0-80平底小ネジにねじ込みます。基盤となる脳組織の損傷を防ぐために、あまりにも深くでネジしないように注意してください。
9. 示した構成にさらに6本のネジに対してこの手順を繰り返し（ 図3B）。すべてのネジのベースに瞬間接着剤を適用します。
10. stereotaxマニピュレータにおける注射針を配置します。基準マークとして、外部の目的の開頭の場所のブレグマ縫合糸から測定し、近くに針で頭蓋内凹みを作るが、。
    注：このデモでは、マークの定位座標は、3ミリメートルの後部とブレグマ縫合に横方向の1ミリメートルである。
11. 永久的なマーカーで凹みをマークします。その定位基準点となるように、マークの定位座標を注 （ 図3B）。
12. 希望する座標（3ミリメートルの後部と、この例ではブレグマへ横3ミリメートル）を中心に開頭術を行います。無傷の硬膜のままにしておきます。修正された人工脳脊髄液（125ミリモルのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1のCaCl _2、1.3のMgCl _2、pH7.4）中^13（ 図3C）との開頭術を覆う。
13. 4に0.2ミリリットルの遠心管をカット - 長さ5mm、およびキャップを切断。頭蓋上にチューブを置き、開頭の上にセンター。
14. 頭蓋にチューブのベースをシールするために、チューブの底を中心に歯科用セメントを適用します。暴露開頭術（ 図3D）にセメントが漏れないように注意してください。
15. 反対側の頭蓋プレート内（直径約1/2）別の小さな穴を開け、慎重に参照線を挿入します。ワイヤの端に記録アンプ（ 設備の項を参照）とのインタフェースピンをハンダ付けして基準線を構築します。それが脳に入ると、これは損傷の原因となり、基準線を移動しないでください。
16. ワイヤが挿入された穴に瞬間接着剤を適用します。これは一時的に所定の位置にピンとワイヤーをシールします。
17. ほぼ等しい部分に（ 材料の項を参照）シリコーンゲルキットの2つの部分を混ぜる。混合およびFILのために2分待ちゲルとの完全なL遠心管約⅓。
18. ヘッドレストバーに（ 材料の項を参照）直角ポストクランプを取り付けます。プレートの底を動物の鼻に向かっているように、45°のピッチ角の保持バー（ 図2B）、ヘッドプレート（ 図2A）を取り付ける。これは、実験的な治具（ 図4）と一致するようにピッチ角を設定する傾斜計を使用することが有用である。
19. バーは耳の棒と平行になるようにstereotaxマニピュレータアームに保持バーを取り付けます。プレートは尾最もネジにラムダ縫合糸と前の後部になるようにバーとプレートを下げます。
20. ねじの頭がダウンして、動物の尾の方に向くように、援助の手アームとクランプで約45°の角度で（ 材料の項を参照、8-32スタッドまたはネジ）フロントヘッドボルトをつかみ。それはアリに触れるようネジを下げるerior 0-80ネジ （ 図3F、G）。
21. 歯科アクリルのある場所にボルトとプレートを固定します。歯科用骨ネジの頭の周りにアクリル、リファレンス·ピン、および遠心管の側面の周りを適用します。歯科アクリルを乾燥するのに約10分を待ちます （ 図3H）。
22. インプラントに皮膚を接合し、歯科アクリルのエッジの周り歯科用セメントの層を適用します。セメントを乾燥するのを待ちます。
23. 遠心管のキャップにいくつかの穴を突く、チューブのキャップを配置します。
24. 援助の手クランプを取り外します。その後、慎重にstereotaxからヘッド保持バーを削除してから、バー（ 図3I）からヘッドプレートを取り外します。
25. stereotaxから動物を削除し、術後ケアとモニタリング、該当するすべての規則に従って、規制、法律（ 例えば、ブプレノルフィン0.02 mg / kgを、24の最小ごとに8-12時間を管理する時間）。炎症はインプラントの縁の周りを開発する場合、解決まで毎日患部に抗生物質軟膏の薄い層を適用する。

ニューロンユニットの3 Juxtacellularモニタリング

1. 炭酸ガスレーザーマイクロピペットプラー上の石英キャピラリーチューブを引っ張る1μm未満（ 図5A）の先端径を有する（ 機器の項を参照）。
   注：加熱パラメータは、特定の機器に応じて変化する、必要なネック径は、関心のある脳構造に依存して変化すること。ラットの視床における記録のために、マイクロピペットは5〜7ミリメートルまでの首を持っている。
2. 長作動距離の目標を装備した微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡下で所定の位置にピペットを固定します。顕微鏡のステージ上で所定の位置にピペットを保持するためのモデリング粘土を使用してください。
3. makのに使用されるガラス片;厚さ1cm - ゆっくりガラスブロック（0.5を移動ウルトラミクロトームナイフをると、ピペットチップで視野に）便利です。ステージマイクロマニピュレーターを用いて、そっとガラスにピペットチップに触れ、それを破る原因。ピペットチップ外径が1-3ミクロンの間になるまで、必要に応じて繰り返します （ 図5B、C）。これらのマイクロピペットは、約5〜15MΩ間のインピーダンスを有していることを確認してください。
4. 細胞外生理食塩水（135のNaCl、5.4のKCl、1.8のCaCl _2、1mMのMgCl _2、5mMのHEPES、NaOHでpH7.2）で^8を準備し、シカゴスカイブルー（w / v）の2％を追加します。 30 G針または小さなシリンジを使用して、溶液をピペットの後端を埋める。あるいは、単一セルjuxtacellular標識のためにシカゴスカイブルーの代わりに生理食塩水に2％（w / v）のNeurobiotinまたはビオチン化デキストランアミン（BDA-3000またはBDA-10000）を追加します。
5. 適切な実験治具に剛性チューブの内側の布の靴下の中にラットを置きます （ 図4）頭部拘束治具に動物を配置する前に、手術後72時間の最小値を.WAIT。気道の閉塞を回避するために、むしろ首よりも、上方の胸骨の周りにドローストリングを締めます。呼吸が苦しいまたは妨げていると思われる場合は、引き紐を緩めるか、後方に移動します。ラットがアラートである間は、この手順を行ってください。
6. ジグの対応ピースにラットにヘッド拘束プレートを取り付けます。これを行うには、最初の場所でヘッド拘束プレートをピンしてから、4-40ネジを使用して固定します。動物が頭に過大なトルクを加えないようにするために穏やかになるまで待つようにしてください。次に、ラットに移植されたヘッド·拘束ボルトに8-32ナットを配置します。その後、ヘッドボルトのねじステンレス製の棒にねじ込みます。それが所定の位置に締め付けることができるような方法で実験的な治具（ 図4）にロッドを固定。
   注：ヘッドボルトならびに頭拘束プレート分で動物を保​​護する装置の曲げimizesと記録安定性を向上させる。ほとんどの場合、記録は、動物が頭抑制され、初日に開始することができる。動物が過度にそわそわまたは発声場合は、すべての録音を開始する前に、ヘッド拘束馴化訓練の一日を提供する。この場合は、15分間の治具に動物を残して、そのケージに戻ってそれを配置します。次の日、この手順を繰り返し、プロトコルを続行。
7. 記録チャンバーを開き、シリコーンゲルを削除します。組織は開頭で再成長してきた場合には罰金ピンセットを用いて開頭術を清掃してください。
8. 電動マイクロマニピュレーターにピペットを取り付け、ヘッドステージ前置増幅器に接続します。
   注：本デモンストレーションでは、ヘッドステージに小さなリレー回路は、増幅器のリード線と高いコンプライアンス（ 図6A-C）と外部電流源を切り替えるために使用される。いくつかのアンプが内蔵され、適切な高コンプライアンス源を持っていることに注意してください（ ディスカッション · 材料のセクションを参照してください）。
9. 記録チャンバー内定位的に識別マークにピペットの先端を移動するための電動マイクロマニピュレーターを使用してください。この場所の座標を注意してください。頭蓋にピペットの先端を壊さないように注意してください。
10. 後部-前方および内外方向の軸で所望の記録位置にピペットを移動します。それが意図された記録場所に約500μmの背側になるまで続いて硬膜を通して腹側にピペットを進める。
11. ピペットチップと基準線との間で記録された増幅された電圧のオーディオモニター上のイベントをスパイクするために聞きながらゆっくりピペットを進める。一度スパイクイベントが識別され、約500μVが観察されているよりも大きな正方向の電圧偏位までピペット0-100ミクロンを移動し続ける。
    注記：電極抵抗は、約1.5〜10のwh倍に増加するこれが発生したEN。
12. ユニットは、関心のあるすべての他の行動や生理的な対策とともに、3.11ステップに従ってとして単離されたら録音を開始。現在のデモンストレーションでは、自己生成された感覚毛の動きは（ 材料の項を参照）、高速ビデオ撮影で監視されている。
13. 記録サイトにラベルを付けるには、電極は、電流源に接続するためにつながる切り替える。手動で、内蔵アンプの電流源、または（ 図6D、ステップ3.8および考察を参照） -いくつかのリレー回路（C図6A）のいずれかを使用してこれを行う方法がある。通過-4μAを2秒パルスで4分間、50％のデューティサイクルでイオン泳動ピペットを通してシカゴスカイブルーを注入する。
14. 標準的な慣行に従って、いくつかの標識方法の後に動物を殺し、灌流。第記録SITの解剖学的位置を特定するために、必要に応じて脳と対比E。 ¹⁴あたりとしてシトクロム酸化酵素反応のための組織を対比。代替的に、蛍光顕微鏡を用いてシカゴスカイブルー沈着を識別する。
    注：正確には、すべてのラベルはラベル間のピペットをアンクランプすることなく、同じ日に同じピペットを用いて作られていることが重要である異なるラベルのユニットを区別するために。この場合、記録部位は（ステップ3.9参照）、各サイトの注目マニピュレータ座標とともに事後​​組織学におけるそれらの相対的な位置によって区別す​​ることができる。明確な同定のために、互いに離れて少なくとも200ミクロン、及び脳領域あたりせいぜい3-5のラベルをラベルをマークします。

結果

エンコード視床腹側後部内側（VPM）におけるニューロンユニット自己生成^15,16を泡立てる時の感覚毛運動の段階。ラットが積極的に泡立てるされる。 図7Bは、スパイクのヒストグラムを示す。図7（a）は、VPM視床単位のサンプルスパイク活性を示す感覚毛の運動¹⁷の瞬時位相に合わせ回。泡立ての収縮期の間、よりスパイクがある。 図7C

ディスカッション

実験的な治具の構築

それは、様々な方法で構築することができるように、実験治具（ 図4）を構築するために使用される機械部品の説明は、プロトコルから省略されている。このデモでは、標準的な光学機械部品とサポートクランプは（ 材料の項を参照）ヘッドレストバーと身体拘束チューブを取り付けるために使用さ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063