Juxtacellular Мониторинг и локализация отдельных нейронов в подкорковых структурах головного мозга оповещения, глава выдержанные крыс

Резюме

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Аннотация

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Введение

Мониторинг нейронной активности в предупреждении животного активно занимается поведенческой задачи имеет решающее значение для понимания функции и организацию нервной системы. Внеклеточной записи электрической активности от отдельных нейронов единиц уже давно штапельного инструмент системной неврологии и до сих пор широко используется в настоящее время. Разнообразие типов электродов и конфигураций доступны в зависимости от научных и технических требований конкретного эксперимента. Хронически имплантировали Microdrives или электродные массивы часто используются в свободно движущихся животных, включая птиц, грызунов и приматов ^1-4. Кроме того, острые проходы с металлическими или стеклянных микроэлектродов через внешний микроманипулятором часто используются для записи с анестезированных или головных-сдерживается животных. Стекло микропипетки электроды имеют то преимущество, что они могут быть использованы в juxtacellular или "клеток, прикрепленный" конфигурации однозначно выделитьдеятельность отдельных нейронов без осложнений после специальной шип сортировки ^5. Эти электроды дополнительно разрешить запись с анатомически определенных клеток или местах, так как они могут быть использованы для введения небольших месторождений красителей или нейроанатомической индикаторов, или даже заполнить отдельные ячейки записаны. Эта конфигурация была успешно применена у крыс, мышей и птиц ^6-10. Сейчас опишем метод сосредотачивается на juxtacellular мониторинга и депозитов внеклеточного красителей в боевой готовности, головные выдержанные крыс. Обратите внимание, что в отличие от одной клетки juxtacellular заполняет эти отложения красителя не предоставляют информацию о морфологии клеток или аксонов прогнозов ^11, но они позволяют точно анатомическую локализацию примерно 50 мкм и, что особенно важно, имеют значительно более высокую доходность оповещения животных. Информация о одноклеточных juxtacellular заполняет тем не менее, при условии, в качестве альтернативной стратегии для анатомической маркировки.

Короче говоря,Протокол состоит из трех основных этапов. На первом этапе, крыса приспособиться к телу пресечения в ткани носка (рис 1) в течение 6 дней. На втором этапе, подголовник аппарат (рис 2) и записи камеры хирургическим путем имплантировали такое, что крысы могут быть сохранены в стереотаксической плоскости в течение нескольких последующих сессиях записи (рисунок 3); Эта процедура позволяет экспериментатору целевой конкретных подкорковых областей мозга для электрофизиологического исследования на основе стандартной ссылкой координаты ^12. Третий этап включает в себя размещение крысу в соответствующем приспособлении для проведения поведенческих и электрофизиологических опытов (рисунок 4), строительство электрод из кварцевой капиллярной трубки (Рисунок 5), что делает juxtacellular нейронные записи, которые однозначно изолировать отдельные единицы ^6-9, и Маркировка анатомические Locatiна сайта записи с Чикаго Небесно-голубой краской (рис 6 и 7). Записи выполняются с одновременным мониторинг поведения; Однако, технические детали поведения будет зависеть от научных целей каждого эксперимента и, таким образом, выходит за рамки одного протокола. После завершения экспериментальной процедуры, которые могут быть повторены на несколько дней, животное эвтаназии. Мозг извлекается и обрабатывается в соответствии со стандартными методами с использованием нейроанатомической либо светлом поле или флуоресцентной микроскопии.

протокол

Экспериментальные протоколы были проведены на самках крыс Long Evans (250 - 350 г) в соответствии с федеральной предписанных руководящих принципов по уходу за животными и использования и были утверждены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в Калифорнийском университете Сан-Диего.

1. акклиматизации крыса тела пресечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Установите крысу на ограниченном рационе. Поток крысу один раз в день сразу после каждого ежедневного сеанса обработки, чтобы акклиматизироваться крысу с ограничением (описано ниже). Обеспечить достаточно корма для поддержания животного при 80% от его первоначального веса. Эта сумма составляет примерно 6 граммов корма в день в течение 250 г женского Long Evans крысы.

1. Акклиматизироваться крысы решаются людьми. Аккуратно сдерживать крысу от руки на периоды примерно 5 сек каждые 30 сек. Делайте это в течение 15 мин в день на 2 дня подряд. Daily Monitor крыс признаки стресса в течение всего периода обучения. Симптомы включают в себя борьбу IРеакция на сдержанность, вокализации и зубной болтовней.
2. На ^3-й день, поместите крысы в кузове-сдерживающим ткани носок (рис 1) в течение 15 мин в день в течение двух последовательных дней.
3. На ^5-й день, поместите крысы внутри носка и поместите носок в виде жесткой трубки на экспериментальной кондуктор (рис 4). Оставьте крысу в трубке в течение 15 мин в день на 2 дня подряд.
4. Немедленно поток крысу после каждой тренировки. В конце последней сессии ^(6-й день) дают неограниченный доступ к пище. Выберите для имплантации только те крысы, которые не показывают признаки чрезмерного стресса на последней тренировочной день.
   Примечание: Хотя выбор для имплантации крыс субъективно, в руках более 90% крыс установлено, что в ответ на привыкание и способны пройти имплантации.

2. Имплантация записывающего механизма палаты и руководитель удерживающих

1. Сделайте Reличие провода пайкой голой проволоки из нержавеющей стали в контактный разъем. Отрежьте провод так, чтобы 3-5 мм останки обнаружили штифтом. Автоклав опорный провод, а также всех хирургических инструментов.
2. Администрирование кетамин / Ксилазин анестезии. Администрирование 95 мг / кг кетамина, смешанного с 5 мг / кг ксилазина внутрибрюшинно. Начальная доза длится 1 ½ до 2 ч. Дополнение анестезии каждые 30-45 мин после того, как необходимо. Смажьте глаза животного с глазной мази.
3. Проверка вывода ног рефлекс, чтобы определить плоскость анестезии и поддержания анестезии, как это необходимо.
4. Поместите крысу в стереотаксической крепежной рамки с уха баров (3А). Бритье волос на голове и дезинфицировать пораженное место с повидон-йода (10% раствор). Позаботьтесь, чтобы вставить уха баров соответствующим образом, чтобы они не повредили барабанную перепонку. Серьги бары с тупыми концами, являются предпочтительными.
5. Сделайте надрез скальпелем Approxiсчете вдоль средней линии черепа от ростро-каудальном уровне глаз к задней части ушей. Используйте ножницы, чтобы вырезать и удалить 2-3 мм полоску кожи по обе стороны от разреза.
6. Соскрести надкостницы подвергать поверхность черепа, чтобы боковых хребтов. Накройте подвергается череп с тонким слоем суперклея.
7. Просверлить маленькое отверстие, с немного меньшим диаметром, чем 0-80 винтов, используя ½ мм Диаметр сверла заусенцев (см материалы раздела). Дрель отверстие сразу позади, где брегма шов встречает Бокового хребта, и под углом 30-45 ° в череп, так что винт может войти с верхней более боковой, чем на нижней.
8. Винт в 0-80 плоским дном крепежный винт в отверстие (примерно на 3 оборота), на уровне 30-45 ° углом. Будьте осторожны, чтобы не винт слишком глубоко, чтобы не повредить лежащую в основе ткани головного мозга.
9. Повторите эту процедуру для 6 дополнительных винтов в конфигурации, показанной (Фиг.3В). Применение суперклей на основе всех винтов.
10. Поставьте иглу шприца в stereotax манипулятора. Измерьте расстояние от темени шва, и сделать вмятину в черепе с иглой ближайшем, но за пределами нужном месте краниотомии, как начало отсчета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой демонстрации, стереотаксической координаты метки 3 мм задняя и 1 мм латеральнее к темени шва.
11. Отметить вмятину с перманентным маркером. Обратите внимание на стереотаксических координат знака, как он будет служить в качестве стереотаксической точки отсчета (3В).
12. Сделать трепанацию черепа с центром на желаемые координаты (3 мм задней и 3 мм латерально относительно брегмы в этом примере). Оставьте твердую мозговую оболочку нетронутыми. Накройте трепанацию черепа с модифицированной искусственной спинномозговой жидкости (125 мМ NaCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 3,1 мМ CaCl _2, 1,3 мМ MgCl _2, рН 7,4) ¹³ (фиг.3С).
13. Вырезать 0,2 мл центрифужную пробирку 4 - 5 мм в длину, и отрезать крышку. Поместите трубку на черепе и в центре его на трепанации черепа.
14. Применение стоматологического цемента вокруг нижней части трубки, чтобы запечатать основание трубки к черепу. Будьте осторожны, чтобы не утечка цемента в открытой трепанации черепа (рис 3D).
15. Бурение еще маленькое отверстие (около ½ мм диаметр) в противоположной черепной пластине и аккуратно вставьте опорный провод. Построить опорный провод с помощью пайки штифт, который взаимодействует с усилителем записи до конца проволоки (смотри раздел оборудования). Не перемещайте опорный провод, когда он находится в головном мозге, поскольку это может привести к его повреждению.
16. Применить суперклей с отверстием, в котором была вставлена ​​проволока. Это уплотнение штифт и проволоки в месте временно.
17. Смешайте две части комплекта силиконовых гелевых (см раздел материалов) примерно в равных частях. Подождите две минуты для смешивания и филл центрифужную пробирку примерно ⅓ полный гелем.
18. Прикрепите под прямым углом сообщению зажим (смотри раздел Материалы) на панели подголовника. Прикрепите голову пластину (рис 2а) с проведением бар (рис 2В) под углом в 45 ° шагом, так что нижняя часть пластины к носу животного. Это полезно использовать угломер установить угол наклона, чтобы соответствовать экспериментальной кондуктор (рис 4).
19. Прикрепите планку держась за stereotax манипулятора, так что бар параллельно уха баров. Опустите планку и пластину так, чтобы пластина задней лямбда шва и передней до хвостового крайнего винта.
20. Возьмитесь за переднюю головной болт (в 8-32 шпильки или винта, смотрите раздел Материалы) примерно в 45 ° угол с руки помощи рычага и зажима, так что головка винта обращена вниз, а к хвосту животного. Опустите винт так, чтобы он касался муравьяerior 0-80 винты (Рисунок 3F, G).
21. Закрепите болт и пластину в месте с зубной акрила. Применение зубной акрила вокруг кости головки винтов, опорный штифт, а по бокам в центрифужную пробирку. Подождите примерно 10 минут для зубов акриловая для сушки (Рисунок 3Н).
22. Нанесите слой зубного цемента вокруг краев зубной акрила, вяжущие кожу имплантата. Подождите, цемент высохнуть.
23. Совать несколько отверстий в крышке центрифуги трубы, и положите крышку на трубе.
24. Снимите руки помощи зажима. Затем осторожно снимите головку-холдинг бар от stereotax, а затем удалить голову пластину из бара (рис 3I).
25. Удалить животное от stereotax и управлять послеоперационный уход и контроль в соответствии со всеми применимыми правил, нормативных актов и законов (например, бупренорфин 0,02 мг / кг, каждые 8-12 ч в течение как минимум 24ч). Если воспаление развивается вокруг краев имплантата, нанесите тонкий слой мази с антибиотиком на пораженное место ежедневно, пока не решен.

3. Juxtacellular Мониторинг нейронных единиц

1. Вынуть кварцевый капиллярной трубки на углекислого газа лазерной микропипетки съемник (смотри раздел оборудования) с диаметром кончика меньше 1 мкм (фиг.5А).
   Примечание: Параметры нагревательные будет варьироваться в зависимости от конкретного инструмента, и что требуемого диаметра шейки варьируется в зависимости от структуры мозга, представляющего интерес. Для записи в крыс таламуса, микропипетки есть шеи, начиная от 5-7 мм.
2. Закрепите пипетки в месте под дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопа, снабженного долгосрочных целей рабочим расстоянием. Используйте пластилина провести пипетку на месте на сцене микроскопа.
3. Медленно перемещайте стеклянную блок (0,5 - 1 см толщиной; кусок стекла, используемого для макчисле ультра-микротомных ножи удобно) в поле зрения с кончика пипетки. Использование стадии микроманипулятором, мягко коснуться кончиком пипетки к стеклу, и ее поломке. При необходимости повторите, пока пипетки наружный диаметр не в пределах 1-3 мкм (5В, С). Убедитесь, что эти микропипетки есть сопротивления между примерно 5-15 МОм.
4. Подготовка внеклеточный раствор (135 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, 5 мМ HEPES, рН 7,2 с помощью NaOH) ⁸ и добавить 2% (вес / объем) Чикаго голубой. С помощью шприца с 30 G иглой или меньшей, заполните заднюю часть пипетки с раствором. Кроме того, для одной ячейки juxtacellular маркировки добавить 2% (вес / объем) Neurobiotin или биотинилированный декстран амин (АРП-3000 или АРП-10000) в солевом растворе в месте Чикаго голубой.
5. Поместите крысу внутри ткани носка внутри жесткой трубки на соответствующем экспериментальном джиг ( Рисунок 4) .Wait минимум 72 ч после операции до размещения животных на голове удерживающих приспособление. Затянуть шнурок вокруг верхней грудины, а не шеи, чтобы избежать обструкции дыхательных путей. Если дыхание по-видимому, трудились или затруднен, ослабьте шнурок или переместить его назад. Выполните эту процедуру, пока крыса оповещения.
6. Прикрепите голова сдерживающее пластину на крысах с соответствующим кусок на джиг. Для этого, во-первых прикрепить голову удерживающих пластину в месте, и затем закрепите его с помощью 4-40 винт. Будьте уверены, чтобы ждать, пока животное не спокойно, чтобы избежать применения избыточный момент в голову. Далее, поместите в 8-32 гайку на лобовом сдерживания болта, который имплантируется на крысу. Тогда винт в резьбовой из нержавеющей стальной стержень в головной болт. Прикрепите стержень в экспериментальной зажима таким образом, что он может быть затянут в месте (рис 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защита животное с головы болта, а также головной сдерживающая пластина минimizes изгиба устройства и улучшает стабильность записи. В большинстве случаев запись может начаться с первого дня животное голова сдержанной. Однако, если животное ерзает чрезмерно или озвучивает, обеспечивают один день глава удерживающих привыкания тренировке перед началом каких-либо записей. В этом случае, оставить животное на оправке в течение 15 мин, а затем поместить его обратно в клетку. Повторите этот шаг на следующий день и продолжить с протоколом.
7. Откройте записи камеры и снимите силиконовый гель. Очистите трепанацию черепа, используя тонкий пинцет, если ткань повторно выращивают в трепанации черепа.
8. Прикрепите пипетки моторизованной микроманипулятором и вставьте в headstage предварительного усилителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем демонстрации, небольшой схема реле на headstage используется для переключения между усилителем выводами и внешнего источника тока с высокой соблюдения (6А-С). Обратите внимание, что некоторые усилители имеют соответствующую Встроенный высококачественный источник соблюдения(См соображений и материалов разделы).
9. Используйте моторизованный микроманипулятор двигаться кончик пипетки к стереотаксически определены знака в записи камеры. Обратите внимание на координаты этого места. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик пипетки на черепе.
10. Перемещение пипетки в нужное место записи в передне-задней и Medio-поперечных осей. Затем перейти пипетку вентрально через твердую мозговую оболочку, пока он не окажется примерно 500 мкм спины от предполагаемого местонахождения записи.
11. Медленно пипетку, прислушиваясь к всплески на аудио монитора усиленного напряжения, записанные между кончиком пипетки и опорной проволоки. После того, как всплески, которые определены, продолжайте двигаться пипетки 0-100 мкм до получения положительных отклонений происходит напряжение большее, чем наблюдается примерно 500 мкВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: сопротивление электродов позволит увеличить на коэффициент примерно 1,5-10 Втан это происходит.
12. Начните запись осуществляется один раз блок был выделен как в соответствии с шагом 3,11, наряду со всеми другими поведенческими и физиологическими показателями, представляющих интерес. В настоящем демонстрации, самогенерирующимся движения вибрисс контролируется с высокой скоростью видеосъемки (см материалы раздела).
13. Для обозначения сайт записи, переключение электродов приводит для подключения к источнику тока. Есть несколько способов сделать это, либо с помощью релейной схемы (рис 6A - C), встроенный в источник тока на усилителе, или вручную (рис 6D, смотрите шаг 3,8 и обсуждение). Pass -4 мкА с 2 сек импульсов на 50% рабочего цикла для 4 мин до ионтофоретически вводить Чикаго Голубой через пипетку.
14. Убейте и заливать животное после нескольких процедур маркировки в соответствии со стандартной практикой. Раздел мозга и контрастирующая мере необходимости для выявления анатомического расположения записи сидетье. Контрастирующая ткань для цитохромоксидазы реактивности как на ^14. Кроме того, определить Chicago Sky Blue депозиты с помощью флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы точно различать разные меченых единиц важно, чтобы все метки сделаны с той же пипеткой в ​​тот же день, без unclamping пипетку между метками. В этом случае запись участки могут быть дифференцированы по их относительного расположения в ретроспективном гистологии вместе с отмеченными манипулятора координат каждого сайта (см шаг 3,9). Для однозначной идентификации, отметьте метки по меньшей мере, 200 мкм друг от друга, и не более, чем 3-5 этикеток в области головного мозга.

Результаты

Нервные узлы в брюшной задней медиальной (ВПМ) таламуса кодирования фазы движения вибрисс во время самостоятельной организации взбивать ^15,16. 7А показан пример всплески активности VPM таламуса устройства, как крысы активно взбивать. 7В показана гистограмма шип...

Обсуждение

Строительство экспериментального джиг

Описание механических частей, используемых для построения экспериментальной приспособление (фигура 4) опущен из протокола, как это может быть построена в различных направлениях. В этой демонстрации стан?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063