Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

Resumo

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Resumo

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Introdução

Monitorando a atividade neuronal em um animal alerta ativamente engajados em uma tarefa comportamental é fundamental para a compreensão da função e organização do sistema nervoso. Gravação extracelular da atividade elétrica das unidades neuronais individuais tem sido um instrumento básico da neurociência sistemas e ainda é amplamente em uso no momento. Uma variedade de tipos de eletrodos e configurações estão disponíveis, dependendo das exigências científicas e técnicas de uma experiência particular. Cronicamente implantado microdrives ou conjuntos de eléctrodos são frequentemente utilizados em animais que se deslocam livremente, incluindo aves, roedores e primatas não-humanos ^1-4. Alternativamente, penetrações agudos com metal ou vidro microeletrodos através de um micromanipulator externa são frequentemente usados ​​para gravar a partir de animais anestesiados ou restringido-cabeça. Eléctrodos de micropipeta de vidro tem a vantagem de que eles podem ser usados ​​na juxtacellular ou "célula ligada" configuração de isolar de forma inequívoca oatividade de neurônios individuais sem as complicações de pico post-hoc de classificação ^5. Estes eléctrodos permitem gravar mais a partir de células ou locais identificados-anatomicamente, como elas podem ser usadas para injectar pequenos depósitos de corantes ou marcadores neuroanatómicos, ou ainda para preencher o indivíduo gravado célula. Esta configuração tem sido aplicado com sucesso em ratos, murganhos e aves ^6-10. A técnica descrita atualmente se concentra em monitoramento juxtacellular e depósitos do corante extracelulares em alerta, ratos conteve-cabeça. Note-se que ao contrário única célula juxtacellular enche, esses depósitos de corante não fornecem informações sobre a morfologia celular ou projeções axonais ^11, mas permitir a localização anatômica exata para cerca de 50 mm e, criticamente, têm um rendimento significativamente maior nos animais de alerta. Informações sobre unicelular juxtacellular enche não deixa de ser fornecido como uma estratégia alternativa para a rotulagem anatômica.

Em breve, oprotocolo consiste em três grandes fases. Na primeira fase, o rato é aclimatados ao corpo de retenção de uma peúga pano (Figura 1) ao longo de um período de 6 dias. Na segunda fase, um aparelho de apoio de cabeça (Figura 2) e câmara de gravação são cirurgicamente implantado de modo a que o rato pode ser mantido no plano estereotáxica durante várias sessões de gravação subseqüentes (Figura 3); este procedimento permite que o experimentador para segmentar regiões sub-corticais específicas do cérebro para o estudo eletrofisiológico com base no padrão de referência de coordenadas ^12. A terceira fase consiste em colocar o rato num gabarito adequado para a realização de experiências comportamentais e electrofisiológicos (Figura 4), ​​a construção do eléctrodo a partir de um tubo capilar de quartzo (Figura 5), fazer gravações neuronais juxtacellular inequivocamente que isolam as unidades individuais ^{de 6-9,} e marcando os locati anatômicasno do local de gravação com Chicago Sky azul corante (figuras 6 e 7). As gravações são realizadas com acompanhamento comportamental simultânea; no entanto, os detalhes técnicos do comportamento dependerá dos objetivos científicos de cada experiência e são, portanto, fora do âmbito de um protocolo único. Após a conclusão do procedimento experimental, o que pode ser repetido em vários dias, o animal é sacrificado. O cérebro é extraído e processado de acordo com as técnicas neuroanatomical padrão usando qualquer campo claro ou microscopia de fluorescência.

Protocolo

Protocolos experimentais foram realizados em ratos fêmeas Long Evans (250-350 g), em conformidade com as orientações de cuidados de animais e utilização federal prescritos e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Califórnia em San Diego.

1. Acclimating do Rato para o Corpo Restraint

NOTA: Coloque o rato em uma dieta restrita. Alimente o rato uma vez por dia, imediatamente após cada sessão de manejo diário para aclimatar o rato para o sistema de retenção (descrito abaixo). Fornecer alimentação suficiente para manter o animal em 80% do seu peso inicial. Este montante é de aproximadamente 6 gramas de ração por dia para um 250 g feminino longo Evans rato.

1. Aclimatar o rato a ser manuseados por humanos. Gentilmente conter o rato com a mão por períodos de cerca de 5 segundos a cada 30 seg. Faça isso por 15 min por dia em dois dias consecutivos. Monitorar os ratos diariamente para sinais de estresse durante o período de treinamento. Os sinais incluem lutando in resposta à contenção, vocalização e dente-vibração.
2. No dia 3 ^rd, colocar o rato em uma peúga pano de restrição do corpo (Figura 1), durante 15 minutos por dia em dois dias consecutivos.
3. No ^5º dia, colocar o rato dentro da meia, e colocar a meia no interior de um tubo rígido no jig experimental (Figura 4). Deixe o rato no tubo durante 15 min por dia em dois dias consecutivos.
4. Alimente o rato imediatamente após cada sessão de treino. No final da última sessão (6 ^° dia) dar acesso restrito ao alimento. Selecione para implantação apenas os ratos que não mostram sinais de estresse excessivo no último dia de treinamento.
   NOTA: Embora selecção de ratos para implantação é subjectiva, nas nossas mãos, mais de 90% dos ratos foram encontrados para ser responsivo a habituação e capaz de se submeter a implantação.

2. Implantação do Mecanismo de gravação Câmara e dos apoios de cabeça

1. Adicione uma refio Conferência soldando fios de aço inoxidável nua para um conector de pino. Corte o fio de modo que 3-5 mm restos descobertos pelo pino. Autoclave o fio de referência, juntamente com todos os instrumentos cirúrgicos.
2. Administrar cetamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de cetamina misturados com 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente. A dose inicial dura 1½ a 2 horas. Suplemento da anestesia cada 30-45 min depois disso, quando necessário. Lubrificar os olhos do animal com uma pomada oftálmica.
3. Verifique o reflexo de retirada do dedo do pé para determinar o plano de anestesia, e manter a anestesia, se necessário.
4. Coloque o rato em uma armação de retenção estereotáxica com barras de ouvido (Figura 3A). Raspar o cabelo na cabeça e desinfectar o local do ferimento com iodopovidona (solução a 10%). Tome cuidado para inserir as barras de ouvido de forma apropriada para que eles não danificar o tímpano. Barras de ouvido com pontas contundentes são preferíveis.
5. Faça uma incisão com um bisturi aproximadamente ao longo da linha média do crânio a partir do nível rostro-caudal dos olhos para a parte de trás das orelhas. Utilize uma tesoura para cortar e remover uma tira de 2-3 mm de pele em ambos os lados da incisão.
6. Raspe o periósteo para expor a superfície do crânio até as nervuras laterais. Cubra o crânio exposto com fina camada de supercola.
7. Faça um furo pequeno, com um diâmetro ligeiramente menor do que 0-80 parafusos, usando uma broca burr ½ mm de diâmetro (ver secção de Materiais). Perfurar o furo imediatamente posterior ao bregma, onde a sutura se encontra com o cume lateral, e a um ângulo de 30-45 ° na cavidade craniana, de modo que o parafuso pode entrar com o topo mais lateral do que o fundo.
8. Parafuso em um parafuso 0-80 máquina de fundo plano para o buraco (aproximadamente 3 voltas), a 30-45 ° ângulo. Tenha cuidado para não enroscar muito profundamente para evitar danificar o tecido cerebral subjacente.
9. Repetir este procedimento para 6 parafusos adicionais na configuração mostrada (Figura 3B). Aplicar supercola para a base de todos os parafusos.
10. Coloque uma agulha da seringa no manipulador stereotax. Medida a partir da sutura bregma, e fazer um dente no crânio com a agulha perto, mas fora do local de craniotomia desejado, como uma marca de referência.
    NOTA: Nesta demonstração, as coordenadas estereotáxica da marca são de 3 mm posterior e 1 mm de laterais à sutura bregma.
11. Marque o dente com um marcador permanente. Observe as coordenadas estereotáxica da marca, uma vez que irá servir como um ponto de referência estereotáxico (Figura 3B).
12. Adicione uma craniotomia centrada nas coordenadas desejadas (de 3 mm posterior e 3 mm lateral ao bregma, neste exemplo). Deixar a dura-máter intacta. Cobrir a craniotomia com fluido cerebrospinal artificial modificado (NaCl 125 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM de _CaCl2, 1,3 mM _MgCl2, pH 7,4) ¹³ (Figura 3C).
13. Corte um tubo de 0,2 ml de centrífuga de 4-5 mm de comprimento, e cortou a tampa. Colocar o tubo no crânio e centralizá-lo sobre a craniotomia.
14. Aplicar cimento dentário em torno da parte inferior do tubo, para vedar a base do tubo para o crânio. Tenha cuidado para não vazar cimento na craniotomia exposta (Figura 3D).
15. Perfurar um outro furo pequeno (cerca de ½ mm de diâmetro) na placa cranial contralateral e insira cuidadosamente o fio de referência. Construir o fio de soldar de referência por um pino que serve de interface com o amplificador de gravação para a extremidade do fio (ver secção Equipamento). Não mova o fio de referência, uma vez que está no cérebro, pois isso pode causar danos.
16. Aplicar supercola para o orifício em que o fio foi inserido. Isto irá selar o pino e fio no lugar temporariamente.
17. Misturar as duas partes do kit de gel de silicone (ver secção de Materiais) em porções aproximadamente iguais. Aguarde dois minutos para misturar e fill do tubo de centrifugação aproximadamente ⅓ completa com gel.
18. Anexar um direito braçadeira pós ângulo (ver secção de materiais) para a barra de apoio de cabeça. Fixar a placa de cabeça (Figura 2A) para a barra de retenção (Figura 2B) a um ângulo de 45 ° passo de modo que o fundo da placa está voltada para o nariz do animal. É útil utilizar um ângulo de inclinação para o ângulo de inclinação definido para coincidir com o dispositivo de montagem experimental (Figura 4).
19. Fixe o bar exploração para o braço stereotax manipulador para que a barra é paralela às barras de ouvido. Abaixe a barra e placa para que o prato é posterior da sutura lambda e anterior ao caudal-mais parafuso.
20. Segure a cabeça do parafuso da frente (8-32 um perno ou parafuso, consulte a secção de Materiais) a cerca de 45 ° de ângulo com um braço e mãos braçadeira de ajudar, de modo que a cabeça do parafuso está voltado para baixo e para a cauda do animal. Abaixe o parafuso para que ele toque a formigaerior 0-80 parafusos (Figura 3F, G).
21. Fixe o parafuso e placa no local com acrílico dental. Aplicar acrílico dental em torno das cabeças dos parafusos de osso, pinos de referência, e em torno dos lados do tubo de centrifugação. Espera aproximadamente 10 min para o acrílico dental para secar (Figura 3H).
22. Aplicar uma camada de cimento dentário em torno das bordas do acrílico dental, solidificando a pele para o implante. Aguarde até que o cimento secar.
23. Pique vários furos na tampa do tubo de centrifugação, e coloque a tampa sobre o tubo.
24. Retire a ajudar as mãos grampo. Em seguida, retire cuidadosamente o bar-segurando a cabeça do stereotax, e, em seguida, retire a placa de cabeça a partir da barra (Figura 3I).
25. Retirar o animal da stereotax e administrar cuidados pós-operatórios e controlo, em conformidade com todas as regras, regulamentos e leis aplicáveis ​​(por exemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, a cada 8-12 horas para um mínimo de 24h). Se a inflamação se desenvolve em torno das bordas do implante, aplica uma camada fina de pomada antibiótica ao local afectado diariamente até resolvido.

3. Monitoramento Juxtacellular de Unidades Neuronal

1. Puxar quartzo tubo capilar sobre uma micropipeta laser de dióxido de carbono puxador (ver secção Equipment) com diâmetros de ponta inferior a 1 mm (Figura 5A).
   NOTA: os parâmetros de aquecimento irá variar de acordo com o instrumento em particular, e que o diâmetro do pescoço requerida irá variar dependendo da estrutura do cérebro de interesse. Para gravações em tálamo rato, micropipetas têm pescoços vão 5-7 mm.
2. Fixe a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC), equipado com objetivos longa distância de trabalho. Use massa de modelar para segurar a pipeta no lugar no palco do microscópio.
3. Mover-se lentamente um bloco de vidro (0,5-1 cm de espessura; um pedaço de vidro usado para making facas ultra micrótomo é conveniente) para dentro do campo de visão com a ponta da pipeta. Usando o micromanipulador fase, tocar suavemente a ponta da pipeta para o vidro, quebrá-la. Repita quantas vezes for necessário até que o diâmetro externo da ponteira é entre 1-3 mm (Figura 5B, C). Certifique-se de que estes micropipettes têm impedâncias entre aproximadamente 5-15 mohms.
4. Preparar solução salina extracelular (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, _CaCl2 1,8 mM, _MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,2 com NaOH) e adicionar 2 ^8% (w / v) de Chicago céu azul. Usando uma seringa com uma agulha de 30 G ou menor, preencher a extremidade traseira da pipeta com a solução. Alternativamente, para rotulagem juxtacellular célula única adicionar 2% (w / v) Neurobiotin ou amina dextrano biotinilado (BDA-3000 ou BDA-10000) para a solução salina em vez de Chicago céu azul.
5. Coloque o rato dentro da meia pano dentro do tubo rígido em um jig experimental adequado ( Figura 4) .Wait um mínimo de 72 horas após a cirurgia, antes de colocar o animal no gabarito dos apoios de cabeça. Apertar o cordão em torno do esterno superior, ao invés do pescoço, para evitar a obstrução das vias aéreas. Se a respiração parece ser trabalhado ou obstruída, solte o cordão ou movê-lo posteriormente. Realizar este procedimento enquanto o rato está alerta.
6. Fixar a placa de cabeça-de restrição sobre o rato para a peça correspondente no gabarito. Para fazer isso, primeiro pino da placa dos apoios de cabeça no lugar e, em seguida, prenda-o com um parafuso 4-40. Certifique-se de esperar até que o animal é calma, a fim de evitar a aplicação de força excessiva na cabeça. Em seguida, coloque uma porca 8-32 no parafuso de retenção da cabeça que é implantado no rato. Então parafuso em uma haste de aço inoxidável com rosca para a cabeça do parafuso. Apor a haste para o dispositivo de montagem experimental, de tal forma que ele pode ser apertado no lugar (Figura 4).
   NOTA: Protegendo o animal com a cabeça do parafuso, bem como o dos apoios de cabeça placa minimizes flexão do aparelho de gravação e melhora a estabilidade. Na maioria dos casos a gravação poderá ser iniciada no primeiro dia o animal está contido-cabeça. No entanto, se o animal fidgets excessivamente ou vocaliza, proporcionar um dia de treinamento de habituação dos apoios de cabeça antes de começar qualquer gravação. Neste caso, deixe o animal no gabarito durante 15 minutos e, em seguida, colocá-lo de volta em sua gaiola. Repita este passo o dia seguinte e continuar com o protocolo.
7. Abra a câmara de gravação e retire o gel de silicone. Limpe a craniotomia usando uma pinça fina se o tecido tem re-cultivadas na craniotomia.
8. Fixe a pipeta para o micromanipulator motorizado, e conecte o headstage pré-amplificador.
   NOTA: No presente demonstração, um pequeno circuito de relé da headstage é usado para alternar entre os fios amplificador de chumbo e uma fonte de corrente externa com alta conformidade (Figura 6A-C). Note que alguns amplificadores têm um adequado built-in fonte cumprimento alta(Ver secções de discussão e de Materiais).
9. Usar o micromanipulador motorizado para deslocar a ponta da pipeta para a marca estereotáxicamente identificado na câmara de gravação. Observe as coordenadas desse local. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da pipeta no crânio.
10. Mova a pipeta para o local de gravação desejado nos eixos ântero-posterior e médio-lateral. Em seguida, avançar o ventralmente pipeta através da dura até que ele é de aproximadamente 500 mm dorsal para o local de gravação pretendida.
11. Avance lentamente a pipeta enquanto escuta para spiking eventos em um monitor de áudio da tensão amplificada gravado entre a ponta da pipeta e o fio de referência. Uma vez que eventos spiking são identificados, continuam a mover-se a pipeta de 0-100 mm até desvios positivos de tensão vai superiores a cerca de 500 mV são observados.
    NOTA: A resistência do eletrodo vai aumentar em um fator de aproximadamente 1,5-10 when esta ocorre.
12. Começar a gravar uma vez por unidade foi isolado como segundo passo 3.11, junto com todas as outras medidas comportamentais e fisiológicas de interesse. No presente demonstração, movimentos Vibrissa auto-geradas são monitorados com videografia de alta velocidade (ver secção de Materiais).
13. Para marcar o local de gravação, mude o eletrodo leva para se conectar à fonte de corrente. Existem várias maneiras de fazer isso, usando um circuito de relê (Figura 6A - C), um built-in fonte de corrente no amplificador, ou manualmente (Figura 6D, veja o passo 3.8 e Discussão). Passe -4 mA com 2 pulsos seg a 50% ciclo de trabalho para 4 min para injetar iontoforéticamente Chicago céu azul através da pipeta.
14. Matar e aspergir o animal depois de vários procedimentos de rotulagem de acordo com a prática habitual. Seção do cérebro e counterstain como necessários para identificar a localização anatômica da gravação sentare. Contracorante o tecido para o citocromo-oxidase reatividade como por ^14. Alternativamente, identificar os depósitos Chicago Sky azuis usando microscopia de fluorescência.
    NOTA: Para diferenciar com precisão entre as diferentes unidades etiquetadas, é importante que todos os rótulos são feitos com a mesma pipeta no mesmo dia, sem desclampeamento a pipeta entre as etiquetas. Neste caso, locais de gravação podem ser diferenciados por suas localizações relativas em histologia post-hoc, juntamente com as coordenadas do manipulador notáveis ​​de cada local (veja o passo 3.9). Para a identificação inequívoca, marcar os rótulos, pelo menos, 200 mm separados um do outro, e não mais de 3-5 etiquetas por região do cérebro.

Resultados

Unidades neuronais em ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar a fase de circulação vibrissa durante o auto-gerado mexendo ^15,16. Figura 7A mostra a atividade spiking amostra de uma unidade thalamic VPM como um rato está mexendo ativamente. Figura 7B mostra um histograma de spike vezes alinhado à fase instantânea de vibrissa movimento ^17. Há mais pontos durante a fase de retração de bater. Depois da gravação, o local da unidade foi marcado a...

Discussão

A construção do gabarito experimental

A descrição dos componentes mecânicos utilizados para construir o dispositivo de montagem experimental (Figura 4) é omitida a partir do protocolo, uma vez que pode ser construído numa variedade de maneiras. Neste padrão demonstração opto-mecânico peças e braçadeiras de apoio são usados ​​para montar o bar apoio de cabeça e do tubo de retenção corporal (ver secção de Materiais)...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solution)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20 - 40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement powder	Dentsply Intl	675571	For the base of the recording chamber
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	For the base of the recording chamber
Silicone gel	Dow Corning	3-4680
Jet denture repair acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline	Sigma	P3813	For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C	Sigma	C2506	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Diaminobenzidine	Sigma	D5905	For cytochrome-oxidase staining, Figure 7
Rat sock	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A	Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½”	U.S. Plastic Co.	34108	Figure 4
Subminiature D pins & sockets	TE Connectivity	205089-1	Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter	Precision Brand Products, Inc.	21010	Figure 3
Stereotaxic holding frame	Kopf Instruments	Model 900	Figure 3
Stereotaxic ear bars	Kopf Instruments	Model 957	Figure 3
Stereotaxic manipulator	Kopf Instruments	Model 960	Figure 3
½ mm drill burr	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air dental drill	Midwest Dental	393-1600
Stainless steel 0-80 ⅛” screw	Fastener superstore	247438	Figure 3
0.2 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	05-407-8A	Figure 3
Custom head-holding bar	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Custom head-holding plate	UCSD SIO Machine Shop	N/A	Custom made, Figures 2 - 4
Right angle post-clamp	Newport	MCA-1	Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 ¾” screw	Fastener Superstore	240181	For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw	Fastener Superstore	239958	For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing	Sutter Instruments	QF-100-60-10	Figure 5
Carbon dioxide laser puller	Sutter instruments	P-2000
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage	Molecular Devices	CV-7B	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolated pulse stimulator	A-M Systems	Model 2100	Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor	Radio Shack	32-2040
Pipette holder	Warner Instruments	#MEW-F10T	Alternate parts: see Discussion, Figure 6A
Electrode lead wire	Cooner wire	NEF34-1646	(optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera	Basler	A602fm	(optional) For behavioral monitoring, Figure 7
Puralube vet ointment	Amazon.com, Inc	NC0138063