Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

GABAergic تثبيط قبل المشبكي هو آلية المثبطة قوية في الحبل الشوكي المهم للمحرك والتكامل الحسي في إشارة الشبكات الحبل الشوكي. ويمكن قياس الكامنة وارد الأولية الاستقطاب عن طريق تسجيل إمكانيات الجذر الظهري (الحزب الثورى الديمقراطى). نحن هنا يبرهن على وجود طريقة في الجسم الحي تسجيل DRP في الفئران.

Abstract

تثبيط قبل المشبكي هي واحدة من آليات المثبطة أقوى في الحبل الشوكي. الآلية الفسيولوجية الأساسية هو الاستقطاب من الألياف وارد الأولية بوساطة GABAergic نقاط الاشتباك العصبي الذخائر المتروكة المحوار (الاستقطاب وارد الأولية). قوة الاستقطاب وارد الأولية يمكن أن تقاس تسجيل إمكانات التي أجريت في حجم الجذر الظهري (إمكانات الجذرية الظهرية، الحزب الثورى الديمقراطى). التغيرات المرضية من تثبيط قبل المشبكي تشكل عاملا حاسما في المعالجة المركزية غير طبيعي للظروف معينة، والألم في بعض اضطرابات فرط الاستثارية السيارات. هنا، نحن تصف طريقة تسجيل DRP في الجسم الحي في الفئران. وأوضح إعداد الحبل الشوكي جذور الظهرية في تخدير الحيوان وإجراءات تسجيل باستخدام أقطاب الشفط. يسمح هذا الأسلوب قياس GABAergic الحزب الثورى الديمقراطى، وبالتالي تقدير تثبيط قبل المشبكي في العمود الفقري في الماوس الحية. في تركيبة مع نماذج الماوس المعدلة وراثيا، قد تسجيل DRP حد ذاتهRVE كأداة قوية لتحقيق المرتبطة بأمراض العمود الفقري الفيزيولوجيا المرضية. في الجسم الحي تسجيل ديها العديد من المزايا مقارنة مع فيفو السابقين الاستعدادات الحبل الشوكي منعزلة، مثل إمكانية التسجيل أو التلاعب في الشبكات فوق الشوك وتحريض من قبل الحزب الثورى الديمقراطى تحفيز الأعصاب الطرفية في وقت واحد.

Introduction

تثبيط قبل المشبكي هي واحدة من آليات المثبطة أقوى في الحبل الشوكي. وهو يحول دون إمكانات بعد المشبكي مثير (EPSPS) في العصبونات الحركية متحمس monosynaptically دون تغيير محتمل الغشاء بعد المشبكي واستثارة من العصبونات الحركية 1-3. الاستقطاب وارد الأولية (PAD) التي تسببها الذخائر المتروكة نقاط الاشتباك العصبي GABAergic المحوار قبل المشبكي على ألياف الحسية هي الآلية الأساسية 4-7 (انظر أيضا Figure1a). هذه نقاط الاشتباك العصبي GABA تحتوي على A-B-GABA ومستقبلات (GABA A R وGABA B R). النشاط GABA A R يؤدي إلى زيادة في كلوريد تصرف الذي يتسبب PAD بسبب توزيع أيون المحلية. هذا الاستقطاب كتل انتشار إمكانات العمل في محطات محوار ويقلل من قوتها مما أدى إلى انخفاض الكالسيوم 2 +-تدفق والحد من إطلاق الإرسال. تنشيط مستقبلات GABA B لا لار المساهمة في PAD ولكن يؤدي إلى الحد من كا 2 +-تدفق وبالتالي تعزيز تثبيط قبل المشبكي. في حين يبدو أن تفعيل GABA A R أن تشارك في تثبيط المدى القصير، وتشارك GABA B R في التشكيل طويلة الأجل 8-10. بالإضافة إلى GABA، التي تمثل الجزء الأكبر من PAD وتثبيط قبل المشبكي، قد نظم الإرسال الأخرى أيضا تعدل والمساهمة في هذا 11،12 آلية.

التغيرات المرضية في تثبيط قبل المشبكي يبدو أن تكون حاسمة في العديد من الحالات المرضية مثل التهاب الطرفية وآلام الأعصاب 13،14، فضلا عن معالجة الألم غير طبيعي المركزي 15، واصابات الحبل الشوكي 16، وأمراض الجهاز العصبي المركزي مع فرط الاستثارية المحرك بوساطة معيبة GABAergic نقل 17، 18. وبالتالي، تقدير تثبيط قبل المشبكي جدير بالاهتمام للتحقيق في الحالات المرضية التجريبية على مستوى النخاع الشوكي في الجسم الحي . PAD يثير إمكانات حجم أجريت توفير مقياسا مباشرا لتثبيط قبل المشبكي في الحبل الشوكي. وتسمى تلك الإمكانات إمكانات الجذرية الظهرية (الحزب الثورى الديمقراطى) ويمكن قياسها من الجذور الظهرية الحبل الشوكي بعد التحفيز من الجذور الظهرية المجاورة 7.

وقد تم الإبلاغ عن القياسات الأولى من DRP في القطط والضفادع 19 ودرست بشكل مكثف في القطط عن طريق اكليس، شميت، وغيرها في أوائل 1970s 3،4،20،21. في حين في الجسم الحي تسجيلات DRP في القطط والفئران 22 23 وقد استخدمت على نطاق واسع، والقياسات في الفئران وقد أجريت بشكل حصري تقريبا في فيفو السابقين معزولة الاستعدادات الحبل الشوكي 15،24. هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل DRP في الفئران تخدير في الجسم الحي السماح مقياسا مباشرا لتثبيط قبل المشبكي في الكائن الحي سليما.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية المذكورة في البروتوكول التالي من قبل سلطات الدولة تورينغن (Thüringer Landesamt FÜR Verbraucherschutz، Reg.-Nr. 02-044/12).

1. الاستعدادات للتجربة

  1. تصنيع أقطاب الشفط
    1. سحب micropipette باستخدام معيار الزجاج الشعرية البورسليكات مع ساحبة micropipette، مثل القطب التصحيح القياسية.
    2. الفرامل الكهربائي لإبعاد قطر من 0.5-1 ملم (أكبر قليلا من قطر الجذور الظهرية) باستخدام ملف الماس.
    3. سوف البولندية الحرارة طرف لذلك لن يضر الجذرية الظهرية عند امتص فيه. معمل الشعلة القياسية تكون مناسبة.
    4. جبل خيوط الزجاج على حامل قطب كهربائي متصلة حقنة من خلالها الضغط السلبي يمكن تطبيقها.
  2. إعداد الحلول
    1. تخدير الفئران حقن لل: مزيج 0.75 مل الكيتامين 10٪، 0.24 مل زيلازين 2٪الثانية 5 مل 0.9٪ المالحة. سيتم حقن 10 ميكرولتر / ز وزن الجسم (BW) من الحل الغشاء البريتونى (الملكية الفكرية).
    2. السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF): تمييع في الماء المقطر مزدوجة الأملاح التالية (مم): كلوريد الصوديوم 134؛ بوكل 3؛ KH 2 PO 4 1.25؛ MgSO 4 • H 2 O 2؛ NaHCO 3 25؛ و CaCl 2 2؛ D- الجلوكوز 10. إضافة H 2 O 2 إلى تركيز النهائي من 0.003٪. دائما استخدام الطازجة الحل.
  3. إعداد الإعداد تسجيل (الشكل 2)
    1. توصيل مكبر للصوت إلى واجهة PC لرقمنة البيانات.
    2. استخدام برنامج الكمبيوتر المستندة إلى توقيت أو التماثلية لتحريك مشجعا نبض مربع، والحصول على البيانات على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر.
    3. استخدام silverwires chlorided متصلة أصحاب الزجاج الكهربائي القياسية كما لتحفيز والتسجيل.
    4. تجميع ثلاثة المتلاعبين لتحفيز وتسجيل والإلكترود المرجعي على التوالي حول إستيرالإطار otactic بالنسبة للفئران، حتى يتسنى لجميع أقطاب الحصول على الحبل الشوكي على استعداد في وقت لاحق.
    5. ربط الأنابيب والحقن لأصحاب القطب أن يكون التفاح لتطبيق الضغط السلبي.

2. تعليقات عامة للتجارب على الحيوانات وإعداد الحيوان للتسجيل الداخلي

  1. أداء جميع التجارب باستخدام الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام كل منها. أداء جميع الجراحة والتسجيلات تحت التخدير العميق ضمان أن معاناة الحيوانات إلى الحد الأدنى.
  2. تخدير الحيوان عن طريق الحقن الملكية الفكرية من الكيتامين / زيلازين (125mg و8mg في ز BW الكيتامين وزيلازين، على التوالي، و 10 ميكرولتر / ز BW من الحل استعداد كما هو موضح أعلاه). إذا لزم الأمر خلال تسجيلات طويلة الأجل، والحقن إضافية يمكن جعل الملكية الفكرية أو ايم
    ملاحظة: الحقن المتكرر من ايم 0.05-0.1 مل من محلول الكيتامين / زيلازين في أعلى الفخذين أثبتت أنها مناسبةللحفاظ على الحيوانات في التخدير العميق لمدة تصل إلى 3 ساعة.
  3. استخدام مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  4. إصلاح رأس الحيوان في إطار المجسم واستخدام وسادة التدفئة مع التحقيق المستقيم وحلقة العاكسة للسيطرة على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء التجربة. التثبيت من الحبل الشوكي في إطار التجسيمي ليست ضرورية.
  5. قبل البدء في إعداد، والتحقق من عمق الخدر التي كتبها العاكسة eyeblink وارتعاش بين أصابع القدم من الفئران. ينبغي إلغاء ردود الفعل.
  6. فتح الجلد على طول خط الوسط فوق الحبل الشوكي من المستوى الصدري العلوي لخفض المناطق القطنية للحصول على حقل تشغيلية واضحة باستخدام مشرط. لا تستخدم مقص لجعل شقوق الجلد. تفقد بعناية الجلد من الأنسجة الكامنة. خلال الخطوات اللاحقة حفاظ على الجرح مبلل بنسبة 0.9٪ المالحة.
  7. قطع الأوتار والأنسجة الضامة على جانبي الفقرات القطنية إلى مستويات من الصدر باستخدام مشرط ومقص.
  8. إزالة العمليات الشائكة وبقية الأنسجة الضامة حول فقرات باستخدام القراص الصغيرة.
  9. الكراك بعناية فقرات مع القراص بدءا من مستويات قطني (L4/L5) تحت مجهر تشريح. يشق غيض من القراص في الفضاء بين الفقرات والحبل الشوكي ورفع قطع العظام عن بعضها البعض. لا تضر الجافية وتجنب الضغط على الحبل الشوكي. كلاهما الحرجة للنجاح. الحفاظ على الحبل الشوكي مبلل أثناء الإجراء بأكمله. المضي قدما إلى مستويات منتصف الصدر.

3. فصل من الجذور الظهرية والحزب الثورى الديمقراطى تسجيل (الشكل 2)

  1. فتح الأم الجافية بعناية باستخدام إبرة رقيقة (30 G) مع طرف عازمة. استخدام ACSF لتبليل من الآن فصاعدا.
  2. فصل الجذور الظهرية قدر الإمكان باستخدام مقياس وقطع اثنين من جذور المجاورة كما القاصي ممكن. قوية سحب على الجذور خلال فصل يؤثر على نجاح التجربة.
  3. خفض الشفط الكهربائي وصولا الى تأليفRSAL الجذور. إضافة قدر ACSF إلى الحبل الشوكي ممكن لأن السائل يساعد على امتصاص الجذور في ظهري.
  4. تمتص نهاية قطع من الجذر الظهرية واحدة في واحدة الماصات الزجاج عن طريق تطبيق الضغط السلبي من خلال حقنة. إذا لزم الأمر، قم بتحريك الجذرية الظهرية أمام افتتاح الكهربائي باستخدام إبرة رفيعة.
  5. إذا كان الجذر الظهرية تقع الجافة داخل القطب الشفط، وإضافة بعض ACSF إلى طرفها في حين مص بعناية حتى يتم تعبئة ماصة بما فيه الكفاية مع ACSF.
  6. بعد امتص الجذرية الظهرية في، ورفع طرف القطب من الحبل الشوكي. الحرص على أن لا "الجسر المياه" بين طرف ماصة والحبل الشوكي القصير دائرة القطب تسجيل / التحفيز.
  7. كرر الخطوات من 3،3-3،6 لجذر المجاورة المماثل.
  8. وضع الإلكترود المرجعي في أقرب وقت ممكن الى الجذور الظهرية والحفاظ عليه من خلال تطبيق ACSF مبلل.
  9. من خلال إنشاء الإعداد التسجيل، يتم اختيار جذر واحد بالفعل لتحفيز وأخرى للتسجيل. زيادة الجهد تدريجية أثناء التسجيل من الجذر الظهرية الثانية يتم في وضع المشبك الحالي. يمكن للمرء أن لاحظت وجود انحراف النزولي قصيرة والتي تبعتها بطيئة، طويلة الأمد انحراف التصاعدي الذي يمثل الحزب الثورى الديمقراطى.
  10. ضبط الجهد حافزا لمستويات فوق الأعظمي وتسجيل العديد من الاحتلالات (لا يقل عن 20 - 30 الاحتلالات / الجذر الظهري عند 0.1 هرتز، وتصفية بين 0.3 هرتز، 3 كيلو هرتز).
  11. تسجيل القطارات قصيرة من ثلاثة المحفزات (100 هرتز) للحصول على معلومات حول الجمع تعتمد على الوقت من الحزب الثورى الديمقراطى.
  12. التبديل تسجيل وموقع التحفيز للتسجيلات المقابل إضافية.
  13. وليس المقصود الحيوانات من أجل البقاء الإجراء. تضحية الحيوانات بعد آخر تسجيل بقطع الرأس في حين لا يزال تحت التخدير العميق (الكيتامين / زيلازين، انظر أعلاه، خطوة 2.2).

4. تحليل البيانات

  1. نقل البيانات إلى برنامج التحليل (مثل سيغما الأرض، ايغور برو، أو MATLAB).
  2. حساب متوسط ​​آثار الابام 20-30 الاحتلالات.
  3. اتخاذ السعة القصوى للانحراف الجهد (من خط الأساس؛ DRP ذروة السعة) لمزيد من التحليل (الشكل 3).
  4. حساب نسبة ذروة السعة DRP بعد ثلاثة البقول ونبض واحد للحصول على قدر من الوقت تعتمد الجمع من إمكانات لاحقة.

النتائج

وتظهر آثار DRP نموذجية في الشكل 3. وعادة ما يعقب تحفيز قطعة أثرية بارزة من خلال انحراف النزولي قصيرة. بعد ذلك بطيئة وطويلة الأمد انحراف التصاعدي، الذي يمثل الحزب الثورى الديمقراطى هو واضح للتمييز. في مجموعة فرعية من التسجيلات، وردود الفعل الجذرية الظهرية مرئي...

Discussion

تسجيلات من خارج وداخل الخلايا الكهربية من نشاط الخلايا العصبية وإمكانات متشابك في الجسم الحي هي دولة من أحدث التقنيات في التحقيق في وظائف الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي والفيزيولوجيا المرضية. التكامل الشوكي هو أمر حاسم لوظيفة الحركية، مثل حركة الأ...

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر مانفريد هيكمان لإجراء مناقشات مفيدة خلال إقامة هذه الطريقة. علاوة على ذلك، نشكر كلوديا سومر للحصول على المساعدة الفنية وفرانك شوبير للدعم إنتاج الفيديو. وأيد هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF)، وألمانيا، FKZ: 01EO1002 والمركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) من مستشفى جامعة يينا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)Science Products (Hofheim, Germany)GB200F-10Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)Braun Melsungen AG 3570350
(Melsungen, Germany)
Rompun 2% (Xylazine)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamin 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)KETAMIN 10%
30G micro needle/ StericanBraun Melsungen AG 4656300
(Melsungen, Geramny)
Salts for aCSFSigma-Aldrich Diverse
S88 Dual Output Square PulseGrass Technologies (Warwick, USA)S88X
Stimulator
SIU5 RF Transformer Isolation UnitGrass Technologies (Warwick, USA)SIU-V
InstruTECH LIH 8+8HEKA (Lambrecht, Deutschland)LIH 8+8 + Patchmaster software
Data acquisition 
Universal amplifiernpi (Tamm, Deutschland)ELC-03X
Micropipette pullerSutter Instruments (Novato, USA)P-1000
Dissecting microscopeOlympus (Tokyo, Japan)
MicromanipulatorSutter Instruments (Novato, USA)MPC-200/MPC-325Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket SystemStoelting (Wood Dale, USA)50300V
Intra-/extracellular recording electrode holderHarvard Apparatus (Holliston, USA)641227

References

  1. Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
  2. Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
  3. Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
  4. Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
  5. Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
  6. Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
  7. Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
  8. Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
  9. Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
  10. Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
  11. Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
  12. Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
  13. Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
  14. Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
  15. Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
  16. Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
  17. Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
  18. Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
  19. Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
  20. Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
  21. Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
  22. Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
  23. Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
  24. Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85 GABA PAD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved