Mesure vertébrale présynaptique inhibition chez la souris par la racine dorsale enregistrement potentiel<em&gt; In Vivo</em

Résumé

GABAergique inhibition présynaptique est un mécanisme inhibiteur puissant de la moelle épinière et le moteur important pour l'intégration du signal sensoriel dans les réseaux de la moelle épinière. Sous-jacent afférent primaire dépolarisation peut être mesurée par l'enregistrement des potentiels de la racine dorsale (DRP). Ici, nous démontrons une méthode d'enregistrement de DRP in vivo chez la souris.

Résumé

Inhibition présynaptique est l'un des mécanismes inhibiteurs les plus puissants de la moelle épinière. Le mécanisme physiologique sous-jacent est une dépolarisation des fibres afférentes primaires médiées par GABAergiques synapses axo-axonale (dépolarisation afférente primaire). La force de la dépolarisation afférente primaire peut être mesurée par l'enregistrement des potentiels de volume menée à la racine dorsale (potentiels de la racine dorsale, DRP). Les modifications pathologiques de l'inhibition présynaptique sont cruciales dans la centrale anormale de certaines conditions de la douleur et dans certains troubles de moteur hyperexcitabilité. Ici, nous décrivons un procédé d'enregistrement DRP in vivo chez la souris. La préparation de la moelle épinière racines dorsales chez l'animal anesthésié et la procédure d'enregistrement à l'aide des électrodes d'aspiration sont expliqués. Cette méthode permet de mesurer GABAergique DRP et ainsi estimer inhibition présynaptique de la moelle chez la souris vivante. En combinaison avec des modèles de souris transgéniques, l'enregistrement peut se DRPrve comme un outil puissant pour étudier la maladie associée à la moelle physiopathologie. enregistrement in vivo a plusieurs avantages par rapport aux ex vivo des préparations isolées de la moelle épinière, par exemple la possibilité d'enregistrer ou de manipulation de réseaux supraspinales et induction de DRP par la stimulation des nerfs périphériques simultanément.

Introduction

Inhibition présynaptique est l'un des mécanismes inhibiteurs les plus puissants de la moelle épinière. Il inhibe potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSPS) dans motoneurones monosynaptique excités sans modifier le potentiel de membrane post-synaptique et l'excitabilité des motoneurones ^1-3. Dépolarisation afférente primaire (PAD) induite par GABAergiques synapses axo-axonale sur des fibres présynaptiques sensorielles est le mécanisme sous-jacent ^4-7 (voir aussi Figure1a). Ces synapses contiennent GABA _{A et} GABA _{B-récepteurs} GABA _A (R et GABA _B R). Activité GABA _A R conduit à une augmentation de la conductance du chlorure PAD qui provoque en raison de la distribution des ions local. Cette dépolarisation bloque la propagation des potentiels d'action dans les terminaisons axonales et réduit leur force conduisant à une diminution de Ca ^{2 +} afflux et une réduction de la libération du transmetteur. L'activation des récepteurs GABA _B ne fait past contribuent au PAD mais conduit à une diminution de Ca ^{2 +-afflux} améliorant ainsi l'inhibition présynaptique. Bien que l'activation de GABA _A R semble être impliquée dans l'inhibition à court terme, le GABA _B R sont impliqués dans la modulation à long terme ^8-10. En plus de GABA, qui représente la majeure partie de la MAP et l'inhibition présynaptique, d'autres systèmes de transmetteurs peuvent également moduler et à contribuer à ce mécanisme ^11,12.

Des changements pathologiques dans l'inhibition présynaptique semblent être crucial dans plusieurs états pathologiques par exemple inflammation périphérique et la douleur neuropathique ^13,14, ainsi que le traitement de la douleur centrale anormale ^15, lésions de la moelle épinière ^16, et les maladies du système nerveux central avec une hyperexcitabilité du moteur médiée par défaut la transmission GABAergique ^{17, 18.} Ainsi, l'estimation de l'inhibition présynaptique est utile d'étudier les conditions pathologiques expérimentales sur le niveau de la moelle épinière in vivo . PAD donne lieu à volumes menée potentiels fournissant une mesure directe de l'inhibition présynaptique dans la moelle épinière. Ces potentiels sont appelés potentiels de racine dorsale (DRP), et peuvent être mesurées à partir de la colonne vertébrale racines cordon dorsales, après stimulation des racines dorsales adjacentes ^7.

Premières mesures de DRP ont été rapportés chez les chats et les grenouilles ¹⁹ et ont été intensément étudié chez les chats par Eccles, Schmidt, et d'autres dans le début des années 1970 ^3,4,20,21. Alors que les enregistrements in vivo de DRP chez les chats et les rats ^{22 23} ont été largement utilisés, les mesures chez la souris ont été réalisées presque exclusivement dans les préparations isolées ex vivo de la moelle épinière ^15,24. Ici, nous décrivons une méthode pour enregistrer DRP chez la souris in vivo anesthésié permettant une mesure directe de l'inhibition pré-synaptique dans l'organisme intact.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales mentionnées dans le protocole suivant a été approuvé par les autorités de l'Etat de Thuringe (Thüringer LANDESAMT für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

Une. Préparatifs pour l'expérience

1. La fabrication des électrodes d'aspiration
   1. Tirez une micropipette en utilisant un capillaire en verre borosilicate standard avec un extracteur micropipette, par exemple une électrode de raccordement standard.
   2. Frein l'électrode à la pointe diamètre de 0,5 à 1 mm (légèrement plus grand que le diamètre des racines dorsales) à l'aide d'un fichier de diamant.
   3. vernis à chaleur de la pointe afin de ne pas nuire à la racine dorsale quand il est aspiré po Une torche de laboratoire standard convenir.
   4. Monter le filament de verre sur un support d'électrode connecté à une seringue à travers lequel la pression négative peut être appliquée.
2. Préparation des solutions
   1. anesthésie par injection chez la souris: Mélanger 0,75 ml de kétamine 10%, 0,24 ml de xylazine 2%e 5 ml saline à 0,9%. 10 ul / g de poids corporel (BW) de la solution sera injectée par voie intrapéritonéale (ip).
   2. Liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF): Diluer dans de l'eau distillée deux fois les sels suivants (en mm): NaCl 134; KCl 3; KH ₂ PO ₄ 1,25; MgSO ₄ • H ₂ O _2; NaHCO ₃ 25; _CaCl2 2, D- glucose 10. Ajouter H ₂ O ₂ à une concentration finale de 0,003%. Utiliser toujours solution fraîchement préparée.
3. Préparation de la configuration d'enregistrement (figure 2)
   1. Connectez l'amplificateur à une interface PC pour numériser les données.
   2. Utilisez un programme basé sur PC ou une minuterie analogique pour déclencher un stimulateur de créneau et d'acquisition de données sur le disque dur du PC.
   3. Utilisez silverwires chlorée connectés au porte-électrodes de verre standards pour la stimulation et l'enregistrement.
   4. Assemblez trois manipulateurs pour la stimulation, l'enregistrement et l'électrode de référence respectivement autour d'un stèreotactic trame pour les souris, de sorte que toutes les électrodes ont accès à la moelle épinière préparé par la suite.
   5. Connectez tuyaux et des seringues pour les porte-électrodes à être pomme pour appliquer une pression négative.

2. Observations générales pour l'expérimentation animale et la préparation des animaux pour la procédure d'enregistrement

1. Effectuez toutes les expériences utilisant des souris selon les directives du comité de protection des animaux et l'utilisation respective. Effectuer toutes les interventions chirurgicales et les enregistrements sous anesthésie profonde assurant que la souffrance des animaux est réduite au minimum.
2. Anesthésier l'animal par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine (125 mg et 8 mg par g BW de kétamine et de xylazine, respectivement, 10 ul / g BW de la solution préparée comme décrit ci-dessus). Si nécessaire pendant les enregistrements à long terme, des injections supplémentaires peuvent être faites ip ou im
   Remarque: répétitives im injections de 0,05-0,1 ml de solution de kétamine / xylazine dans le haut des cuisses se sont révélés être adaptépour garder l'animal en anesthésie profonde jusqu'à 3 h.
3. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
4. Fixer la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique et d'utiliser un coussin chauffant avec sonde rectale et boucle réflexe de contrôler la température du corps de l'animal lors de l'expérience. Fixation de la moelle épinière dans un cadre stéréotaxique n'est pas nécessaire.
5. Avant de commencer la préparation, vérifiez la profondeur de la narcose par réflexe du clignement de paupières et secousses entre les orteils des souris. Réflexes devraient être abolies.
6. Ouvrez la peau le long de la ligne médiane au-dessus de la moelle épinière au niveau thoracique haut en bas la région lombaire pour obtenir un champ opérationnel clair à l'aide d'un scalpel. Ne pas utiliser des ciseaux pour faire des incisions cutanées. Perdre soigneusement la peau à partir du tissu sous-jacent. Au cours des étapes ultérieures de garder la plaie humide de 0,9% de solution saline.
7. Couper les tendons et les tissus conjonctifs de chaque côté des vertèbres lombaires à partir de niveaux thoraciques en utilisant un scalpel et ciseaux.
8. Retirez les apophyses épineuses et le reste du tissu conjonctif autour des vertèbres à l'aide d'une petite pince.
9. Casser délicatement vertèbres avec la pince à partir de niveaux lombaires (L4/L5) de sous un microscope à dissection. Shove la pointe de la pince dans l'espace entre les vertèbres et la moelle épinière et soulever des morceaux d'os en dehors. Ne pas nuire à la mère et éviter la pression de la moelle épinière. Les deux sont essentiels pour le succès. Gardez la moelle épinière humide durant toute la procédure. Procéder à des niveaux mi-thoraciques.

3. Séparation des racines dorsales et DRP enregistrement (Figure 2)

1. Ouvrez la dure-mère soigneusement à l'aide d'une aiguille fine (30 G) avec une pointe recourbée. Utilisez aCSF pour humidifier à partir de maintenant.
2. Séparer les racines dorsales, autant que possible en utilisant le gabarit et couper deux racines adjacentes distale que possible. Vigoureuse traction sur les racines au cours de la séparation affecte le succès de l'expérience.
3. Abaisser l'électrode d'aspiration vers le doRSAL racines. Ajouter autant aCSF à la moelle épinière que possible parce que le liquide permet d'aspirer les racines dorsales.
4. Aspirer l'extrémité d'une racine dorsale coupée dans une pipettes en verre par application d'une pression négative par l'intermédiaire d'une seringue. Si nécessaire, déplacer la racine dorsale en avant de l'ouverture de l'électrode à l'aide d'une aiguille fine.
5. Si la racine dorsale est sec à l'intérieur de l'électrode d'aspiration, ajouter un peu de aCSF à la pointe tout en suçant soigneusement jusqu'à ce que la pipette est suffisamment rempli aCSF.
6. Après la racine dorsale est aspiré, puis soulever la pointe de l'électrode à partir de la moelle épinière. Veillez à ce que non "pont d'eau" entre la pointe de la pipette et la moelle épinière de court-circuit l'électrode d'enregistrement / stimulation.
7. Répétez les étapes 3.3 à 3.6 pour une racine adjacente ipsilatéral.
8. Placez l'électrode de référence aussi proche que possible de la racine dorsale et le garder humide en appliquant aCSF.
9. En établissant la configuration de l'enregistrement, une racine est déjà choisi pour la stimulation, lal'autre pour l'enregistrement. Augmenter la tension par étapes lors de l'enregistrement de la deuxième racine dorsale se fait en mode pince de courant. On peut remarquer une déviation courte vers le bas qui est suivie d'une lente durable déviation, vers le haut représentant de la DRP.
10. Régler la tension de relance pour supramaximal niveaux et enregistrer plusieurs balayages (au moins 20 - 30 balayages / racine dorsale à 0,1 Hz, filtre entre 0,3 Hz à 3 kHz).
11. Enregistrez trains courts de trois stimuli (100 Hz) pour obtenir des informations sur la somme en fonction du temps de la DRP.
12. Mettez l'enregistrement et le site de stimulation pour les enregistrements controlatérale supplémentaires.
13. Les animaux ne sont pas destinés à survivre à l'opération. Sacrifier des animaux après le dernier enregistrement par décapitation tout en restant sous anesthésie profonde (kétamine / xylazine, voir ci-dessus, l'étape 2.2).

4. Analyse des données

1. Transférer des données à un programme d'analyse (par exemple Sigma Plot, Igor Pro, ou MATLAB).
2. Calculer traces moyens frOM 20-30 balayages.
3. Prendre l'amplitude maximale de la déviation de la tension (à partir de la ligne de base; DRP pic d'amplitude) pour une analyse ultérieure (figure 3).
4. Calculer le rapport de l'amplitude crête DRP après trois impulsions et une seule impulsion pour obtenir une mesure de la somme dépend des potentiels ultérieurs de temps.

Résultats

Traces DRP typiques sont présentés dans la figure 3. L'artefact de stimulation importante est généralement suivie d'une déviation vers le bas à court. Par la suite, une longue durée de déviation vers le haut lent, représentant le DRP se distingue nettement. Dans un sous-ensemble d'enregistrements, dorsales réflexes profondes sont visibles sous forme de petites pointes sur le dessus de la DRP. Chez les souris de type sauvage normales, réflexes racines dorsales apparaissent le plus ...

Discussion

Enregistrements électrophysiologiques extra-et intracellulaires de l'activité neuronale et potentiels synaptiques in vivo sont l'état de l'art des techniques pour enquêter sur les fonctions neuronales du système nerveux central et la physiopathologie. Spinal intégration est critique pour la fonction motrice, par exemple, les mouvements des membres et de la perception sensorielle multimodale. Inhibition présynaptique est un mécanisme essentiel dans ce processus de calcul assurer des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)	Braun Melsungen AG	3570350
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamine 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30 G Microneedle/ Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
Salts for aCSF	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 Dual Output Square Pulse	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster software
Universal amplifier	NPI (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
Micropipette puller	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
Dissecting microscope	Olympus (Tokyo, Japan)
Micromanipulator	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket System	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
Intra-/extracellular recording electrode holder	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227