後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

要約

GABA作動性シナプス前抑制は、モータと脊髄ネットワークでの感覚信号の統合のための重要な脊髄の強力な阻害のメカニズムです。基礎となる一次求心性の脱分極は、後根電位（DRP）の記録により測定することができる。ここでは、マウスにおけるDRP のインビボ記録する方法を実証する。

要約

シナプス前抑制は、脊髄の中で最も強力な阻害メカニズムの1つです。基本的な生理学的なメカニズムは、GABA作動性AXO-軸索シナプス（一次求心性脱分極）が介在する一次求心性線維の脱分極である。一次求心性脱分極の強度は、後根（後根電位、DRP）で体積を行っ電位を記録することによって測定することができる。シナプス前抑制の病理学的変化は、特定の疼痛症状の異常な中央演算処理において、モータ過剰興奮のいくつかの疾患において重要である。ここでは、マウスにおいてインビボで DRPを記録する方法を記載している。麻酔した動物および吸引電極を用いて記録手順における脊髄後根の調製について説明する。この方法は、GABA作動性、DRPを測定し、それによって生きているマウスでは脊髄シナプス前抑制を推定することができます。トランスジェニックマウスモデルとの組み合わせで、DRP記録月SE疾患関連脊椎の病態生理学を研究するための強力なツールとしてRVEは、 インビボ記録は、 例えば、同時記録又は脊柱上のネットワークおよび末梢神経の刺激によるDRPの誘導の操作の可能性をex vivoで単離された脊髄調製物と比較していくつかの利点を有する。

概要

シナプス前抑制は、脊髄の中で最も強力な阻害メカニズムの1つです。これは、シナプス後膜電位および運動ニューロン^1-3の興奮性を変更することなく、monosynaptically興奮運動ニューロンにおける興奮性シナプス後電位（EPSPS）を阻害する。感覚シナプス前繊維にGABA作動性AXO-軸索シナプスによって誘導された一次求心性脱分極（PAD）は、基本的なメカニズム^4-7（もFigure1aを参照）である。これらのシナプスは、GABA _Aと GABA _B受容体（GABA _A R及びGABA _B R） ​​を含んでいる。 GABA _A Rの活性は、ローカルイオン分布にPADを誘発クロライドコンダクタンスの増加をもたらす。この脱分極をブロック軸索終末に活動電位の伝播と減少したのCa ^{2 +}流入と伝達物質放出の減少をもたらす彼らの強さを軽減します。 GABA _B受容体_の活性化はないなしトンPADに寄与せず^、+流入は、それによってシナプス前抑制を増強するCa ² +の減 ​​少をもたらす。 GABA _A Rの活性化が短期阻害に関与しているように見える一方で、GABA _B Rは、長期^8-10変調に関与している。 PADとシナプス前抑制の大部分を占めるGABAに加えて、他の送信機システムはまた調節する可能性があり、この機構^11,12に寄与する。

シナプス前抑制における病理学的変化は^、欠陥のあるGABA作動性伝達¹⁷によって媒介運動過剰興奮性と末梢性炎症および神経障害性疼痛^13,14、ならびに異常な中枢性疼痛処理^15、脊髄損傷^16、およびCNS疾患、例えば 、いくつかの疾患状態において重要であると思わ^18。従って、シナプス前抑制を推定するin vivoでの脊髄レベルに関する実験病理学的状態を調査する価値がある。 PADは、脊髄におけるシナプス前抑制の直接的な尺度を提供するボリューム行わ電位を生じさせる。これらの電位は、後根電位（DRP）と呼ばれ、隣接する背側根⁷の刺激後に脊髄後根から測定することができる。

DRPの最初の測定値は、猫やカエル¹⁹で報告されており、集中的に、1970年代初頭^3,4,20,21にエクルズ、シュミット、そして他の人が猫で研究した。ネコおよびラット^{22 23} DRP のインビボ記録は、広く使用されてきたが、マウスでの測定は、ほぼ独占的にex vivoで単離された脊髄調製物^15,24に行われている。ここでは、完全な生物体におけるシナプス前抑制の直接測定を可能に生体内で麻酔したマウスでは、DRPを記録する方法を説明している。

プロトコル

以下のプロトコルに記載されている全ての実験手順は、チューリンゲン州当局（テゥーリンガーLandesamtエリーゼVerbraucherschutz、Reg.-Nr. 02-044/12）によって承認された。

1。実験に向けた準備

1. 吸引電極の作製
   1. 例えば 、標準のパッチ電極マイクロピペットプラー、標準ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用してマイクロピペットを引き出します。
   2. ブレーキダイヤモンドファイルを使用して（背側根の直径よりもわずかに大きい）0.5〜1ミリメートルの直径を傾けるための電極。
   3. 熱ポリッシュは、それが標準的な実験トーチインチ吸引する際には、後根に害を与えないように先端が適切であろう。
   4. 負圧を適用することができる介してシリンジに接続された電極ホルダにガラスフィラメントを取り付ける。
2. 溶液の調製
   1. マウス用の注射麻酔：0.75ミリリットルケタミン10パーセント、0.24ミリリットルキシラジン2％Aを混ぜるND 5ミリリットル0.9％生理食塩水。溶液10μl/ gの体重（BW）は、腹腔内（ip）注射する。
   2. 人工脳脊髄液（ACSF）：（単位：mm）再蒸留水に希釈し、次の塩：NaClの134;塩化カリウム3、KH ₂ PO ₄ 1.25、硫酸マグネシウム_{4•H 2} O 2、 _炭酸水素ナトリウム25、 _塩化カルシウム2、D-グルコース10。 0.003％の最終濃度までH ₂ O _2を追加する。常に新鮮に調製した溶液を使用してください。
3. 録画設定します（ 図2）の調製
   1. データをデジタル化するためのPCインターフェースにアンプを接続します。
   2. PCのハードドライブ上の方形パルス刺激とデータ収集をトリガするために、PCベースのプログラムまたはアナログタイマを使用。
   3. 刺激と記録用として標準的なガラス電極ホルダに接続塩素化silverwiresを使用してください。
   4. ステールのまわり、それぞれの刺激、記録と参照電極のための3つのマニピュレータを組み立てるマウスについてのotacticフレーム、全ての電極は、後で準備脊髄へのアクセス権を持つように。
   5. 負圧を適用するリンゴであると電極ホルダにチューブや注射器を接続します。

2。記録手順のための動物実験や動物の準備のための一般的なコメント

1. それぞれの制度的動物管理使用委員会のガイドラインに従って、マウスを使用して、すべての実験を行う。動物の苦痛を最小化していることを確実にする、深い麻酔下で、すべての手術との録音を行う。
2. （;上記のように調製した溶液を10μl/ G BWのそれぞれ125mgのケタミン及びキシラジン、のG BWあたり8mgの）ケタミン/キシラジンの腹腔内注射することによって動物を麻酔。長期記録時に必要な場合、追加の注射は腹腔内または筋肉にすることができる
   注：0.05〜0.1の反復筋肉内注射を上部大腿部におけるケタミン/キシラジン溶液のmlを適切であることが証明されている最大3時間、深麻酔で動物を維持する。
3. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
4. 定位フレームに動物の頭部を固定し、実験中、動物の体温を制御するために、直腸プローブと反射的ループで加熱パッドを使用しています。定位フレーム中の脊髄の固定は必要ありません。
5. 準備を始める前に、マウスの足の指の間に瞬目反射および単収縮による麻酔の深さを確認してください。反射は廃止すべき。
6. メスを用いて明確な運用のフィールドを取得するために腰椎の領域を下げる胸部上部レベルから脊髄上記の正中線に沿って皮膚を開きます。皮膚切開を行うためにハサミを使用しないでください。慎重に下にある組織から皮膚を失う。その後の工程の間に0.9％生理食塩水で湿らせた傷を保つ。
7. 小刀やはさみを使って胸椎レベルに腰椎から脊椎の両側に腱および結合組織を切断する。
8. 小さなニッパーを使って脊椎の周りの棘突起および結合組織の残りの部分を削除します。
9. 慎重に解剖顕微鏡下で腰椎レベル（L4/L5）から始まるニッパーで脊椎割れ。脊椎と脊髄の間の空間にニッパーの先端を突き出すと離れて骨片を持ち上げます。硬膜を害すると脊髄に圧力を避けるためにしないでください。どちらも、成功のために重要である。全体の手順の間、湿らせた脊髄に保管してください。半ば胸部のレベルに進みます。

3。後根およびDRPの記録を分離します（図2）

1. 慎重に曲がった先端を細い針（30 G）を使用して硬膜を開きます。これから加湿のためのaCSFを使用してください。
2. ゲージを使用して、可能な限り後根を分離し、可能な限り遠位として2隣接根を切る。活発な分離の間に根を引っ張ると、実験の成功に影響を与えます。
3. DOに吸引電極を下に下げるRSALルーツ。液体は後根を吸引するのに役立ちますので、可能な限り、脊髄に限りのaCSFを追加します。
4. シリンジを介して負圧を印加することによって一方のガラスピペット内に1後根の切断端を吸う。必要に応じて、細い針を使用し、電極開口部の前面に後根を移動します。
5. 後根は、吸引電極内の乾燥にある場合、慎重に吸引しながら、ピペットを十分のaCSFで満たされるまで、その先端にいくつかのaCSFを追加します。
6. 後根が吸い込まれた後、脊髄から電極先端を高めています。ピペットチップや脊髄短絡記録/刺激電極の間には "水の橋」と注意してください。
7. 繰り返します同側隣接するルートのための3.3から3.6を繰り返します。
8. 後根にできるだけ近い参照電極を配置し、aCSFのを適用することで湿らせ、それを維持する。
9. 録画設定を確立することによって、1ルートがすでに刺激のために選択され、録音用です。二後根から記録が電流クランプモードで行われている間、電圧を段階的に増やします。一つは、DRPを表す遅く、長期的な上向きのたわみが続いている短い下方への撓みが発生することがあります。
10. （ - 0.1ヘルツ、0.3ヘルツ、3 kHzの間のフィルタで30スイープ/後根少なくとも20）のレベルを最大上、いくつかのスイープを記録するための刺激電圧を調整します。
11. DRPの時間依存合計に関する情報を取得するために3つの刺激（100ヘルツ）の短い列車を記録します。
12. 追加の対側記録に記録し、刺激部位を切り替える。
13. 動物を手順に耐えることを意図するものではない。まだ深麻酔下にある間断頭により最後の記録の後に動物を犠牲に（ケタミン/キシラジン、上記参照、ステップ2.2）。

4。データ解析

1. 解析プログラムにデータを転送（ 例えばシグマプロット、イゴールプロ、またはMATLAB）。
2. 平均トレースFRを計算するOM、20〜30スイープ。
3. さらに分析するため（ 図3）、（DRPのピーク振幅ベースラインからの）電圧振れの最大振幅をとる。
4. その後のポテンシャルの時間依存合計の測定値を得るために3パルスと単一パルスの後に、DRPのピーク振幅の比を計算します。

結果

典型的なDRPトレースを図3に示す。著名な刺激アーティファクトは通常は短い下方への撓みが続いている。その後、DRPを表す遅い、長期持続上向き偏向は、明確に区別される。録音の一部では、脊髄後根反射は、DRPの上に小さなスパイクとして表示されます。刺激電圧が過剰になると正常な野生型マウスでは、後根反射は最も頻繁に現れる。後根反射神経がこの準備に再現性よく?...

ディスカッション

in vivoでの神経活動やシナプス電位の細胞外および細胞内電気生理学的記録は、CNS神経機能と病態生理を調査中の最新技術である。脊髄統合は、運動機能などの四肢の動きやマルチモーダル感覚知覚するために重要である。シナプス前抑制は、感覚入力への適切な対応を確保すること、この計算プロセスにおける1重要なメカニズムである。のIa求心性線維上のGABA作動性シナプス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)	Braun Melsungen AG	3570350
(Melsungen, Germany)
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamin 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30G micro needle/ Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
(Melsungen, Geramny)
Salts for aCSF	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 Dual Output Square Pulse	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
Stimulator
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster software
Data acquisition
Universal amplifier	npi (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
Micropipette puller	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
Dissecting microscope	Olympus (Tokyo, Japan)
Micromanipulator	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket System	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
Intra-/extracellular recording electrode holder	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227