Mess Spinal Präsynaptische Hemmung bei Mäusen durch Spinalgan Mögliche Aufnahme<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

GABAergen präsynaptischen Hemmung ist ein leistungsfähiges hemmende Mechanismus im Rückenmark wichtig für die motorische und sensorische Signalintegration in Rückenmark-Netzwerke. Basiswert primären afferenten Depolarisation kann durch die Aufnahme von Hinterwurzel Potentiale (DRP) gemessen werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur in-vivo-Aufnahme von DRP in Mäusen.

Zusammenfassung

Präsynaptischen Inhibierung ist eine der stärksten inhibitorischen Mechanismen im Rückenmark. Die zugrunde liegende physiologische Mechanismus ist eine Depolarisation der primären afferenten Fasern durch GABA-erge axo-axonale Synapsen (primäre afferente Depolarisation) vermittelt. Die Stärke der primären afferenten Depolarisation durch Aufnahme der auf das Volumen durchgeführt, die Potentiale an den dorsalen Wurzel (Hinterwurzelpotentiale DRP) gemessen werden. Pathologische Veränderungen der präsynaptischen Hemmung sind in der abnormen zentralen Verarbeitung bestimmter Schmerzzuständen und in einigen Störungen des Motor Übererregbarkeit von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Aufzeichnen DRP in vivo in Mäusen. Die Vorbereitung des Rückenmarks Rücken Wurzeln in der narkotisierten Tier und der Aufnahmeverfahren mit Saug-Elektroden werden erläutert. Diese Methode ermöglicht die Messung GABAerge DRP und damit die Schätzung Rücken präsynaptischen Hemmung in der lebenden Maus. In Kombination mit transgenen Mausmodellen, kann DRP Aufnahme serve als ein leistungsfähiges Werkzeug, um krankheitsassoziierten Rücken Pathophysiologie zu untersuchen. In-vivo-Aufnahme hat mehrere Vorteile im Vergleich zu ex vivo isolierten Rückenmark Mittel, wie zB die Möglichkeit der gleichzeitigen Aufnahme oder Manipulation von supraspinalen Netzwerke und Induktion von DRP durch Stimulation der peripheren Nerven.

Einleitung

Präsynaptischen Inhibierung ist eine der stärksten inhibitorischen Mechanismen im Rückenmark. Es hemmt die exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) in monosynaptisch angeregten Motoneuronen, ohne die postsynaptischen Membranpotential und die Erregbarkeit der Motoneuronen ^1-3. Primär afferente Depolarisation (PAD), die durch GABA-erge axo-axonale Synapsen auf sensorische präsynaptischen Fasern induziert wird, ist der zugrunde liegende Mechanismus ^4-7 (siehe auch Abbildung 1a). Diese Synapsen enthalten GABA _{A-und GABA-B-Rezeptoren} (GABA _A R-und GABA _B-R). GABA _{A-R-Aktivität} führt zu einer Erhöhung der Chlorid-Leitfähigkeit, die PAD aufgrund des lokalen Ionenverteilung hervorruft. Diese Depolarisation blockiert die Ausbreitung von Aktionspotentialen in die Axon-Terminals und reduziert ihre Stärke, die zu einer verminderten Ca ^{2 +-Einstrom} und eine Reduktion der Transmitterfreisetzung. Aktivierung der _{GABA-B-Rezeptoren} tut nichtt PAD beitragen, aber zu einer Verringerung der Ca ^{2 +-Einstrom} wodurch präsynaptischen Inhibierung. Während die Aktivierung der GABA _A R scheint in kurzen Zeithemmung beteiligt sind, werden GABA _B-R der langfristigen Modulation ^8-10 beteiligt. Neben GABA, die den größten Teil der PAD und präsynaptischen Hemmung ausmacht, könnten auch andere Sender Systeme modulieren und dazu beitragen, diesen Mechanismus ^11,12.

Pathologische Veränderungen in der präsynaptischen Hemmung scheint entscheidend zu sein in mehreren Krankheitszuständen wie zB periphere neuropathische Schmerzen und Entzündungen ^13,14 sowie abnorme zentrale Schmerzverarbeitung ^15, Verletzungen des Rückenmarks ¹⁶ und ZNS-Erkrankung mit motorischen Übererregbarkeit durch defekte GABAergen Transmission ¹⁷ vermittelt ^{werden, 18.} So Schätzung präsynaptischen Hemmung lohnt sich, experimentellen pathologischen Bedingungen auf der Ebene des Rückenmarks in vivo zu untersuchen . PAD entsteht Volumen durchgeführt Potentiale eine direkte Messung der präsynaptischen Inhibierung im Rückenmark. Diese Potentiale werden Hinterwurzel Potentiale (DRP) genannt und kann von Rückenmark dorsalen Wurzeln nach Stimulation von benachbarten dorsalen Wurzeln ⁷ gemessen werden.

Erste Messungen von DRP haben bei Katzen und Frösche ¹⁹ gemeldet und wurden intensiv bei Katzen von Eccles, Schmidt und andere, in den frühen 1970er Jahren ^3,4,20,21 sucht. Während in vivo-Aufnahmen von DRP bei Katzen ²² und ²³ Ratten wurden weit verbreitet, Messungen in Mäusen wurden fast ausschließlich im ex vivo isolierten Rückenmark Zubereitungen ^15,24 durchgeführt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur DRP an narkotisierten Mäusen in vivo ermöglicht eine direkte Messung der präsynaptischen Inhibierung im intakten Organismus aufzuzeichnen.

Protokoll

Alle in der folgenden Protokoll erwähnten experimentellen Verfahren wurden von den Thüringer Landesbehörden (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12) zugelassen.

1. Die Vorbereitungen für Experiment

1. Herstellung von Saug-Elektroden
   1. Ziehen einer Mikropipette mit einem Standard-Borosilikatglas Kapillare mit einer Mikropipette Puller, zB einem Standard-Patch-Elektrode.
   2. Brems die Elektrode-zu-Durchmesser von 0,5-1 mm (etwas größer als der Durchmesser der dorsalen Wurzeln) unter Verwendung eines Diamantfeilenspitze.
   3. Wärmelack die Spitze, so wird es nicht schaden, die Hinterwurzel, wenn es in. Ein Standard-Laborbrenner angesaugt wird, ist geeignet.
   4. Montieren der Glasfaden auf einem Elektrodenhalter mit einer Spritze durch den Unterdruck anlegbar ist.
2. Herstellung der Lösungen
   1. Injektionsanästhesie für Mäuse: Mix 0,75 ml Ketamin 10%, 0,24 ml Xylazin 2%nd 5 ml 0,9% Kochsalzlösung. 10 ul / g Körpergewicht (BW) der Lösung wird intraperitoneal (ip) injiziert werden.
   2. Künstliche Liquor (aCSF): Verdünnen in doppelt destilliertem Wasser die folgenden Salze (in mM): NaCl 134; KCl 3; KH ₂ PO ₄ 1,25; MgSO ₄ • H ₂ O 2; NaHCO ₃ 25; CaCl _{2 2,} D- Glukose 10. Add H ₂ O ₂ zu einer Endkonzentration von 0,003%. Verwenden Sie stets frisch hergestellten Lösung.
3. Vorbereitung der Aufnahme-Setup (Abbildung 2)
   1. Verbinden Sie den Verstärker an eine PC-Schnittstelle zur Digitalisierung von Daten.
   2. Verwenden Sie ein PC-Programm oder ein Analog-Timer, einen Rechteckimpuls Stimulator und Datenerfassung auf PC-Festplatten ausgelöst werden.
   3. Verwenden chlorierten silverwires zu Standard-Glaselektrodenhalter als für die Stimulation und Aufzeichnung verbunden.
   4. Montieren Sie drei Manipulatoren für Stimulation, Aufnahme-und Referenzelektrode, die jeweils um eine stereotactic Rahmen für Mäuse, so dass alle Elektroden haben Zugriff auf die vorbereitete Rückenmarks später.
   5. Schließen Schläuche und Spritzen zu den Elektrodenhalter Apfelunterdruck anwenden.

2. Allgemeine Kommentare für Tierversuche und Tier Vorbereitung für Aufnahmeverfahren

1. Führen Sie alle Experimente mit Mäusen nach den Richtlinien des jeweiligen institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschusses. Führen Sie alle Operationen und Aufnahmen unter tiefer Anästhesie sicherzustellen, dass das Leiden der Tiere minimiert.
2. Betäuben das Tier durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (125 mg und 8 mg pro g BW von Ketamin und Xylazin sind; 10 ul / g BW der hergestellten Lösung wie oben beschrieben). Wenn bei Langzeitaufnahmen erforderlich, können weitere Injektionen ip oder im geführt werden
   Hinweis: Repetitive im Injektionen von 0,05-0,1 ml Ketamin / Xylazin-Lösung in den Oberschenkeln haben sich als geeignet erwiesen, um das Tier in tiefer Narkose für bis zu 3 Stunden halten.
3. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
4. Befestigen Sie den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Rahmen und verwenden Sie ein Heizkissen mit rektale Sonde und Reflex-Schleife, um die Körpertemperatur des Tieres während des Experiments zu kontrollieren. Fixierung der Wirbelsäule in einem stereotaktischen Rahmen ist nicht erforderlich.
5. Vor dem Start der Vorbereitung, überprüfen Narkosetiefe durch eyeblink Reflexzuckungen und zwischen den Zehen der Mäuse. Reflexe sollte abgeschafft werden.
6. Öffnen Sie die Haut entlang der Mittellinie über dem Rückenmark von der oberen Brustwirbelsäule Lendenwirbelsäule zu Bereichen zu senken, um ein klares operatives Feld mit einem Skalpell zu bekommen. Verwenden Sie keine Schere, um Hautschnitte zu machen. Vorsichtig lösen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebe. Während der folgenden Schritte halten die Wunde um 0,9% Kochsalzlösung befeuchtet.
7. Geschnitten Sehnen und des Bindegewebes an beiden Seiten der Wirbelkörper von Lenden-thorakalen Ebenen mit Skalpell und Schere.
8. Entfernen Sie die Dornfortsätze und der Rest der Bindegewebe um die Wirbel mit einer kleinen Zange.
9. Sorgfältig Wirbel knacken mit der Zange ab lumbalen Ebenen (L4/L5) unter einem Binokular. Schieben Sie die Spitze der Zange in den Raum zwischen den Wirbeln und Rückenmark und Knochenstücke heben auseinander. Schaden Sie nicht die Dura und vermeiden Druck auf das Rückenmark. Beide sind entscheidend für den Erfolg. Halten des Rückenmarks während des gesamten Verfahrens befeuchtet. Fahren Sie mit mittlerer Thorax Ebenen.

3. Die Trennung von Rücken Wurzeln und DRP-Aufnahme (Abbildung 2)

1. Öffnen Sie die Dura mater vorsichtig mit einer dünnen Nadel (30 G) mit einem gebogenen Spitze. Verwenden Sie zum Befeuchten aCSF von nun an.
2. Trennen Sie die dorsalen Wurzeln so weit wie möglich mit der Spurweite und schneiden zwei benachbarten Wurzeln als distal wie möglich. Kräftiges Ziehen an den Wurzeln während der Trennung wirkt sich der Erfolg des Experiments.
3. Senken Sie die Saug-Elektrode bis zum doRSAL Wurzeln. Hinzufügen soviel aCSF des Rückenmarks wie möglich, weil Flüssigkeit hilft, in den dorsalen Wurzeln saugen.
4. Saugen das abgeschnittene Ende einer dorsalen Wurzel in eine Glaspipette durch Anlegen von Unterdruck durch eine Spritze. Wenn nötig, verschieben Sie die Hinterwurzel vor der Elektrodenöffnung mit einer feinen Nadel.
5. Wenn die Hinterwurzel in der Saug-Elektrode liegt trocken, fügen Sie einige aCSF bis zu seiner Spitze, während sorgfältig saugen, bis die Pipette ausreichend mit aCSF gefüllt.
6. Nachdem die Hinterwurzel angesaugt wird, heben Sie die Elektrodenspitze aus dem Rückenmark. Darauf achten, dass keine "Wasserbrücke" zwischen der Pipettenspitze und des Rückenmarks Kurzschluss der Aufnahme / Stimulationselektrode.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,6 für einen ipsilateralen benachbarten Wurzel.
8. Positionieren Sie den Referenzelektrode so nah wie möglich an den hinteren Wurzeln und halten Sie sie, indem aCSF befeuchtet.
9. Mit der Gründung der Aufnahme-Setup wird eine Wurzel bereits zur Stimulation ausgewählt, dieandere für die Aufnahme. Spannung erhöhen schrittweise während der Aufnahme aus der zweiten Rücken Wurzel wird in der Stromklemme Modus. Man kann einen kurzen Ausschlag nach unten, die durch eine langsame, lang anhaltende Ausschlag nach oben, die die DRP folgt bemerken.
10. Stellen Sie die Reizspannung auf Werte supramaximale und notieren mehrere Sweeps (mindestens 20 - 30 Sweeps / Hinterwurzel bei 0,1 Hz, Filter zwischen 0,3 Hz-3 kHz).
11. Nehmen Sie kurze Züge von drei Stimuli (100 Hz), um Informationen über die zeitabhängige Summation der DRP zu bekommen.
12. Schalten Ableitung und Stimulation Website für weitere kontralateralen Aufnahmen.
13. Tiere sind nicht dazu gedacht, das Verfahren zu überleben. Sacrifice Tiere nach der letzten Aufnahme durch Enthauptung noch unter tiefer Narkose (Ketamin / Xylazin, siehe oben, Schritt 2.2).

4. Datenanalyse

1. Übertragen Sie Daten-Analyse-Programm (z. B. Sigma Plot, Igor Pro, oder MATLAB).
2. Berechnen Sie die durchschnittliche Spuren from 20-30 Sweeps.
3. Nehmen die maximale Amplitude der Spannung Biegung (von der Basislinie; DRP Spitzenamplitude) zur weiteren Analyse (Fig. 3).
4. Berechnung des Verhältnisses der Spitzenamplitude DRP nach drei Impulsen und Einzelimpuls um ein Maß für die zeitabhängige Summierung der nachfolgenden Potentiale zu gewinnen.

Ergebnisse

Typische DRP Spuren sind in Fig. 3 gezeigt. Die prominente Stimulationsartefakt wird üblicherweise durch eine kurze Abwärtsbiegung folgt. Danach ein langsamer, dauerhafte Auslenkung nach oben, die die DRP deutlich unterscheidbar. In einer Untergruppe von Aufnahmen sind Algan Reflexe, wie kleine Spitzen auf der Oberseite der DRP sichtbar. Im normalen Wildtyp-Mäusen, erscheinen Hinterwurzel Reflexe meistens, wenn Stimulationsspannung ist zu hoch. Da die Spinalgan Reflexe nicht mit hoher Reproduzierbark...

Diskussion

Extra-und intrazellulären elektrophysiologischen Ableitungen neuronaler Aktivität und synaptische Potentiale in vivo sind Stand der Technik Techniken bei der Untersuchung von ZNS neuronale Funktionen und Pathophysiologie. Spinal Integration ist entscheidend für die motorische Funktion, z. B. Bewegung des Körpers und für multimodale Sinneswahrnehmung. Präsynaptischen Hemmung ist einer kritischen Mechanismus in diesem Rechenvorgang eine angemessene Reaktionen auf Sinneseindrücke. GABAergen Synapse...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)	Braun Melsungen AG	3570350
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamine 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30 G Microneedle/ Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
Salts for aCSF	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 Dual Output Square Pulse	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster software
Universal amplifier	NPI (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
Micropipette puller	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
Dissecting microscope	Olympus (Tokyo, Japan)
Micromanipulator	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket System	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
Intra-/extracellular recording electrode holder	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227