배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정<em&gt; 생체</em

요약

GABA 성 시냅스 억제는 모터와 척수 네트워크에서 감각 신호 통합을위한 중요한 척수에서 강력한 억제 메커니즘입니다. 기초 기본 심성의 탈분극은 후근 전위 (DRP)의 기록에 의해 측정 할 수있다. 여기에서 우리는 생쥐의 DRP의 생체 기록하는 방법을 보여줍니다.

초록

시냅스 억제는 척수에서 가장 강력한 억제 메커니즘 중 하나입니다. 기본 생리 학적 메커니즘은 GABA 성 AXO - 축삭의 시냅스 (기본 심성 탈분극)에 의해 매개 차 구 심성 섬유의 탈분극입니다. 기본 심성 탈분극의 강도는 후근 (후근 전위, DRP)에 볼륨 실시 전위의 기록에 의해 측정 할 수있다. 시냅스 억제의 병리학 적 변화는 특정 두통 상태의 비정상적인 중앙 처리 및 모터 hyperexcitability 일부 질환에 중요하다. 여기, 우리는 생쥐에서 생체 내에서 기록 DRP하는 방법을 설명합니다. 마취 된 동물 흡입 전극을 사용하여 기록 절차의 척수 등쪽 뿌리의 제조는 설명합니다. 이 방법은 GABA 성 DRP를 측정함으로써 살아있는 마우스에서 척추 시냅스 억제를 추정 할 수 있습니다. 형질 전환 마우스 모델과 함께, DRP 녹화 할 수있다 SE질병 관련 척추의 병태 생리를 조사 할 수있는 강력한 도구로 RVE는. 생체 내 기록은 예를 들어, 동시 녹음 또는 supraspinal 네트워크 및 말초 신경의 자극에 의해 DRP의 유도 조작의 가능성 생체 고립 척수 준비에 비해 몇 가지 장점이 있습니다.

서문

시냅스 억제는 척수에서 가장 강력한 억제 메커니즘 중 하나입니다. 그것은 시냅스 막 잠재력과 운동 신경원 ^1-3의 흥분을 변경하지 않고 monosynaptically 흥분 운동 신경원의 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSPS)을 억제한다. 감각 시냅스 섬유에 GABA 성 AXO - 축삭의 시냅스에 의해 유도 된 기본 심성 탈분극 (PAD)는 기본 메커니즘 ^4-7 (도 Figure1a 참조). 이 시냅스는 GABA _{A-와 B-GABA} 수용체 (GABA R과 GABA _B R)를 포함하고있다. GABA R 활동으로 인해 로컬 이온 분포에 PAD를 이끌어 클로라이드 컨덕턴스의 증가에 이르게한다. 이 탈분극 블록은 축삭 터미널에 활동 전위의 전파와는 감소 ^칼슘으로 이어지는 그들의 힘을 감소 ⁺ - 유입 및 송신기 방출의 감소. GABA _{B 수용체의} 활성화는 않습니다 없음t는 PAD에 기여하지만, 이에 연접 억제를 강화하는 칼슘 ^{2 +} 유입의 감소로 연결됩니다. GABA R의 활성화는 단기간의 억제에 관여하는 것으로 보이지만, GABA _B R은 장기 변조 ^8-10에 참여하고 있습니다. PAD와 연접 억제의 주요 부분을 차지하는 GABA에 더하여, 다른 송신기 시스템은 또한 변조 할 수 있으며이기구 ^{(11, 12)에} 기여한다.

시냅스 억제의 병리학 적 ^변화는, 결함이있는 GABA 성 전송 ^(17)에 의해 매개 모터 hyperexcitability와 주변 염증 및 신경 병증 성 통증 ^{(13, 14)뿐만} 아니라, 이상 중앙 통증 처리 ^(15), 척수 손상 ^16, 중추 신경계 질환을 예를 들어 여러 가지 질병 상태에 중요한 것 같습니다 ^18. 따라서 시냅스 억제를 추정하는 것은 생체 내에서 척수 수준에서 병리학 실험 조건을 조사 할 가치가있다 . PAD는 척수 연접 억제의 직접 측정을 제공하는 양 실시 전위를 일으킨다. 그 잠재력은 후근 전위 (DRP)라고 인접 등의 뿌리 ^(7)의 자극 후 척수 등쪽 뿌리에서 측정 할 수있다.

DRP의 첫 번째 측정은 고양이와 개구리 ^19에보고 된 집중적으로 1970 년대 초 ^{3,4,20,21에서} 에클 스, 슈미트, 그리고 다른 사람에 의해 고양이에서 공부했다. 고양이 ^(22)와 쥐 ²³ DRP의 생체 내 녹음이 널리 사용되었지만, 마우스의 측정은 거의 독점적으로 생체 고립 척수 준비 ^15,24에서 수행되었다. 여기서, 우리는 본래 유기체 시냅스 억제 직접적인 측정을 허용 생체 내에서 마취 된 쥐에서 DRP를 기록하는 방법을 설명한다.

프로토콜

다음 프로토콜에 언급 된 모든 실험 절차는 튀 링겐 주 당국 (링거 Landesamt FÜR Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12)에 의해 승인되었다.

1. 실험을위한 준비

1. 흡입 전극의 제작
   1. 예를 들어, 표준 패치 전극 마이크로 피펫 풀러와 표준 붕규산 유리 모세관을 사용하여 마이크로 피펫을 잡아 당깁니다.
   2. 브레이크 다이아몬드 파일을 사용하여 (등쪽 뿌리의 직경보다 약간 큰) 0.5 mm의 직경을 팁을 전극.
   3. 열 광택이 표준 실험실 토치 안으로 빨려 때 등의 루트를 해가되지 않도록 끝이 적당 할 것이다.
   4. 부압이인가 될 수있는 주사기에 연결된 전극 홀더에 유리 필라멘트를 탑재.
2. 솔루션의 제조
   1. 마우스의 경우 주입 마취 : 825 ml의 케타민에게 10 %를 혼합, 0.24 ml의 자일 라진 2 %차 5 ㎖의 0.9 % 식염수. 용액 10 μL / g의 체중 (BW)는 (IP)을 복강 내 주사한다.
   2. 인공 뇌척수 (ACSF) :;의 KCl 3, KH ₂ PO ₄ 1.25, _망초 • H ₂ O 2, _탄산 수소 나트륨 (25), _염화칼슘 2, D-NaCl을 134 : 두 번 증류수 (mm 단위) 다음과 같은 염을 희석 10 포도당. 0.003 %의 최종 농도로 H ₂ O _2를 추가. 항상 신선하게 준비된 솔루션을 사용합니다.
3. 녹화 설정의 준비 (그림 2)
   1. 데이터를 디지털화하기위한 PC 인터페이스에 앰프를 연결합니다.
   2. PC 하드 드라이브의 사각 펄스 자극 및 데이터 수집을 트리거하는 PC 기반 프로그램 또는 아날로그 타이머를 사용합니다.
   3. 자극과 녹음으로 표준 유리 전극 홀더에 연결 염화물로 silverwires를 사용합니다.
   4. stere 주위에 각각 자극, 기록 및 기준 전극에 대한 세 가지 조종 조립마우스에 대한 otactic 프레임, 모든 전극이 나중에 준비 척수에 액세스 할 수 있도록.
   5. 부정적인 압력을 적용하는 사과로 전극 홀더에 호스와 주사기를 연결합니다.

2. 동물 실험 및 녹음 과정에 대한 동물 준비에 대한 일반적인 설명

1. 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 마우스를 사용하는 모든 실험을 수행합니다. 동물의 고통을 최소화 할 것을 보장 깊은 마취하에 모든 수술과 녹음을 수행합니다.
2. (; 상기와 같이 제조 된 용액 10 μL / g의 BW 각각 125mg과 케타민과 자일 라진의 G의 BW 당 8mg의) 케타민 / 자일 라진의 IP 주입하여 동물을 마취. 장기 녹화 중에 필요한 경우 추가 주사는 IP 또는 IM을 할 수있다
   주 : 0.05 ~ 0.1의 반복 임 주사를 허벅지 위쪽에있는 케타민 / 자일 라진 용액 ㎖를 적합한 것으로 입증최대 3 시간 동안 깊은 마취에서 동물을 유지합니다.
3. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
4. 정위 프레임에서 동물의 머리를 고정하고 실험 기간 동안 동물의 체온을 조절하는 직장​​ 프로브 및 휘어진 루프 가열 패드를 사용한다. 고정대에있는 척수의 고정이 필요하지 않습니다.
5. 준비를 시작하기 전에, 마우스의 발가락 사이 eyeblink 반사 및 경련에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 반사 신경은 폐지되어야한다.
6. 메스를 사용하여 클리어 연산 필드를 얻을 요추 영역을 낮추는 상부 흉추 레벨로부터 척수 상기 정중선을 따라 피부를 연다. 피부 절개를 만들기 위해 가위를 사용하지 마십시오. 조심스럽게 하부 조직으로부터 피부를 느슨하게. 다음 단계는 0.9 % 식염수에 적신 상처를 계속하는 동안.
7. 메스와 가위를 사용하여 힘줄과 가슴 수준으로 요추에서 척추의 양쪽에 결합 조직을 잘라.
8. 작은 니퍼를 사용하여 척추 주위의 극돌기 및 결합 조직의 나머지 부분을 제거합니다.
9. 조심스럽게 니퍼 해부 현미경 요추 수준 (L4/L5)에서 시작하는 척추 균열. 척추와 척추 사이의 공간에 니퍼의 끝을 밀어과 떨어져 뼈 조각을 들어 올립니다. 경질을 해와 척수에 압력을 피하지 마십시오. 모두의 성공을 위해 중요하다. 전체 절차를 수행하는 동안 적신 척수를 유지합니다. 중반 흉부 수준으로 진행합니다.

3. 지느러미 뿌리와 DRP 기록의 분리 (그림 2)

1. 조심스럽게 구부러진 끝으로가는 바늘 (30 G)를 사용하여 경막을 엽니 다. 지금부터 습에 ACSF를 사용합니다.
2. 게이지를 사용하여 가능한 한 등의 뿌리를 분리하고 가능한 한 말단으로 인접한 두 뿌리를 잘라. 격렬한 분리하는 동안 뿌리에 당기는 실험의 성공에 영향을 미친다.
3. 할 수있는 흡입 전극을 아래로 내립니다뿌리를 rsal. 액체 등의 뿌리에서 빨아 수 있기 때문에 가능한 한 척추에 많은 ACSF를 추가합니다.
4. 주사기를 통해 부정적인 압력을 적용하여 하나의 유리 피펫에 하나의 지느러미 루트의 단면을 빨아. 필요한 경우, 미세 바늘을 사용하여 전극의 구멍 앞에 지느러미 루트를 이동합니다.
5. 지느러미 루트 흡입 전극에서 건조에있는 경우 피펫 충분히 ACSF 가득 될 때까지주의 깊게 빨고있는 동안, 그 팁을 몇 가지 ACSF를 추가합니다.
6. 등의 루트를 흡입 한 후, 척수에서 전극의 끝 부분을 올립니다. 주의하는 피펫 팁 및 척수 단락의 기록 / 자극 전극 사이에 "물 다리".에게
7. 반복 동측 인접 루트에 대한 3.3-3.6 단계를 반복합니다.
8. 등의 뿌리에 최대한 가깝게 기준 전극을 배치하고 ACSF을 적용하여 촉촉하게 유지합니다.
9. 녹화 설정을 구축함으로써, 하나의 루트가 이미 자극을위한 선택,기록에 대한 다른. 두 번째 지느러미 루트에서 기록이 현재 클램프 모드에서 수행하는 동안 전압을 단계적으로 증가한다. 하나는 DRP를 나타내는 천천히, 오래 지속 상향 편향에 의해 다음에 짧은 하향 편향을 알 수 있습니다.
10. (- 0.1 Hz에서 30 스윕 / 후근, 0.3 Hz에서 3 kHz에서 필터를 적어도 20) 수준을 supramaximal 여러 스윕을 기록하는 자극의 전압을 조정합니다.
11. DRP의 시간에 따른 합산에 대한 정보를 얻기 위해 세 가지 자극 (100 Hz에서)의 짧은 기차를 기록합니다.
12. 추가 반대측 기록에 대한 기록 및 자극 사이트를 전환합니다.
13. 동물 절차를 생존하는 것은 아니다. 반면 여전히 깊은 마취 (케타민 / 자일 라진은, 위 참조 2.2 단계) 잘린 마지막 촬영 후 동물을 희생.

4. 데이터 분석

1. 분석 프로그램에 데이터를 전송 (예 : 시그마 플롯, 이고르 프로, 또는 MATLAB).
2. 평균 추적의 FR을 계산톰 20-30 스윕.
3. 추가 분석을 위해 (그림 3), (DRP 피크 진폭 기준에서) 전압 편향의 최대 진폭을 가지고.
4. 후속 전위의 시간 종속 합산의 측정치를 얻기 위해 세 개의 펄스 및 단일 펄스 후에 DRP 피크 진폭의 비율을 계산한다.

결과

전형적인 DRP 흔적은도 3에 나타낸다. 눈에 띄는 자극 이슈는 일반적으로 짧은 아래로 편향옵니다. 그 후 DRP 나타내는 느리고 오래 상향 편향은, 명확히 구별이다. 녹음의 하위 집합으로, 지느러미 루트 반사 신경 DRP의 상단에 작은 스파이크로 볼 수 있습니다. 자극의 전압이 과도한 경우 정상적인 야생형 생쥐에서 지느러미 루트 반사 신경이 가장 자주 나타납니다. 지느러미 루트 반사...

토론

생체 내에서 신경 세포의 활동과 시냅스 전위의 추가 및 세포 내 전기 생리학 기록은 중추 신경계 신경 세포의 기능과 병태 생리를 조사하는 예술 기술의 상태입니다. 척추 통합 운동 기능, 예를 들면 사지 운동과 복합 감각 인식에 중요합니다. 시냅스 억제 감각 입력에 적절한 대응을 보장이 계산 과정에서 하나의 중요한 메커니즘이다. 아이오와 구 심성 섬유에 GABA 성 시냅스가 PAD?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)	Braun Melsungen AG	3570350
(Melsungen, Germany)
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamin 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30G micro needle/ Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
(Melsungen, Geramny)
Salts for aCSF	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 Dual Output Square Pulse	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
Stimulator
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster software
Data acquisition
Universal amplifier	npi (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
Micropipette puller	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
Dissecting microscope	Olympus (Tokyo, Japan)
Micromanipulator	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket System	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
Intra-/extracellular recording electrode holder	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227