Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Riepilogo

GABAergica inibizione presinaptica è un potente meccanismo inibitorio nel midollo spinale importante per il motore e l'integrazione del segnale sensoriale in reti midollo spinale. Sottostante afferenti primari depolarizzazione può essere misurata mediante registrazione dei potenziali radice dorsale (DRP). Qui mostriamo un metodo di registrazione in vivo di DRP nei topi.

Abstract

Inibizione presinaptica è uno dei più potenti meccanismi inibitori nel midollo spinale. Il meccanismo fisiologico alla base è una depolarizzazione delle fibre afferenti primarie mediate da GABAergici sinapsi axo-assonale (primaria depolarizzazione afferente). La forza di primaria depolarizzazione afferente può essere misurata mediante registrazione dei potenziali volumi condotto alla radice dorsale (potenziali radice dorsale, DRP). Le alterazioni patologiche di inibizione presinaptica sono cruciali nella elaborazione centrale anormale di alcune condizioni di dolore e in alcuni disturbi di ipereccitabilità del motore. Qui, si descrive un metodo di registrazione DRP in vivo nei topi. La preparazione del midollo spinale radici dorsali nella procedura di registrazione utilizzando elettrodi di aspirazione animale anestetizzato e sono spiegato. Questo metodo permette di misurare GABAergica DRP e quindi stimare inibizione presinaptica spinale nel topo vivente. In combinazione con modelli di topi transgenici, la registrazione DRP può serve come un potente strumento per studiare associata a malattia del midollo fisiopatologia. In vivo la registrazione ha diversi vantaggi rispetto alle ex vivo isolato preparazioni midollo spinale, ad esempio, la possibilità di registrazione simultanea o manipolazione di reti sopraspinali e induzione di DRP dalla stimolazione dei nervi periferici.

Introduzione

Inibizione presinaptica è uno dei più potenti meccanismi inibitori nel midollo spinale. Inibisce potenziali postsinaptici eccitatori (EPSPS) in motoneuroni monosinaptica eccitati senza modificare il potenziale di membrana post-sinaptica e l'eccitabilità dei motoneuroni ^1-3. Depolarizzazione afferenti primari (PAD) indotta da GABAergici sinapsi axo-assonale su fibre presinaptiche sensoriali è il meccanismo sottostante ^4-7 (vedi anche Figure1a). Queste sinapsi contengono GABA _{A e} GABA _B recettori GABA _A (R e GABA _B R). Attività GABA _A R porta ad un aumento della conduttanza cloruro che suscita PAD dovuto alla distribuzione ione locale. Questo blocca depolarizzazione la propagazione dei potenziali d'azione nei terminali dell'assone e riduce la loro forza con conseguente riduzione del Ca ^{2 +-afflusso} e una riduzione del rilascio trasmettitore. Attivazione dei recettori GABA _B non fat contribuiscono al PAD ma porta ad una riduzione di Ca ^{2 +-afflusso} migliorando così inibizione presinaptica. Mentre l'attivazione di GABA _A R sembra essere coinvolto nella inibizione breve termine, GABA _B R sono coinvolti nella modulazione a lungo termine ^8-10. Oltre al GABA, che rappresenta la maggior parte del PAD e l'inibizione presinaptica, altri sistemi di trasmettitori possono anche modulare e contribuire a questo meccanismo ^11,12.

Alterazioni patologiche inibizione presinaptica sembrano determinanti in diversi stati patologici esempio infiammazione periferica e dolore neuropatico ^13,14, così come anormale trasformazione dolore centrale ^15, lesioni del midollo spinale ^16, e malattie del SNC con ipereccitabilità motore mediata da difettoso trasmissione GABAergica ^{17, 18.} Pertanto, la stima inibizione presinaptica la pena di indagare sulle condizioni patologiche sperimentali a livello del midollo spinale in vivo . PAD dà luogo a potenziali volumi condotti forniscono una misura diretta della inibizione presinaptica nel midollo spinale. Tali potenzialità sono chiamati potenziali radici dorsali (DRP) e possono essere misurati dal spinale radice spinale dorsale dopo stimolazione delle radici dorsali adiacenti ^7.

Le prime misure di DRP sono stati riportati in gatti e rane ¹⁹ e sono state intensamente studiate nei gatti da Eccles, Schmidt e altri nei primi anni 1970 ^3,4,20,21. Mentre le registrazioni in vivo di DRP nei gatti ²² e ²³ ratti sono stati ampiamente utilizzati, misurazioni nei topi sono stati condotti quasi esclusivamente in ex vivo isolato preparazioni midollo spinale ^15,24. Qui, descriviamo un metodo per registrare DRP in topi anestetizzati in vivo permette una misura diretta di inibizione presinaptica nell'organismo intatto.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali di cui al seguente protocollo sono stati approvati dalle autorità statali della Turingia (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. Preparativi per Experiment

1. Fabbricazione di elettrodi di aspirazione
   1. Tirare una micropipetta con un capillare di vetro borosilicato di serie con un estrattore micropipetta, ad esempio, un elettrodo di patch standard.
   2. Freno l'elettrodo a punta diametro di 0,5-1 mm (leggermente più grande del diametro delle radici dorsali) utilizzando un file di diamante.
   3. Polish calore la punta in modo da non danneggiare la radice dorsale quando viene risucchiato dentro una torcia laboratorio standard sarà adatto.
   4. Montare il filo di vetro su un supporto di elettrodo collegato ad una siringa attraverso il quale la pressione negativa può essere applicata.
2. Preparazione di soluzioni
   1. Anestesia iniettabile per topi: Miscelare 0,75 ml di ketamina 10%, 0,24 ml xylazina 2%nd 5 ml di soluzione fisiologica 0,9%. 10 microlitri / g di peso corporeo (BW) della soluzione viene iniettata per via intraperitoneale (ip).
   2. Liquido cerebrospinale artificiale (aCSF): diluire in acqua bidistillata i seguenti sali (in mm): 134 NaCl, KCl 3; KH ₂ PO ₄ 1,25; MgSO ₄ • H ₂ O 2; NaHCO ₃ 25; CaCl _2, 2, D- glucosio 10. Aggiungere H ₂ O ₂ ad una concentrazione finale di 0,003%. Utilizzare una soluzione sempre preparata al momento.
3. Preparazione della configurazione di registrazione (Figura 2)
   1. Collegare l'amplificatore ad una interfaccia PC per la digitalizzazione dei dati.
   2. Utilizzare un programma basato su PC o un timer analogico per innescare uno stimolatore impulso quadrato e l'acquisizione dei dati sul disco rigido del PC.
   3. Utilizzare silverwires chlorided collegati alla porta elettrodi vetro standard, per la stimolazione e la registrazione.
   4. Montare tre manipolatori per la stimolazione, la registrazione e l'elettrodo di riferimento, rispettivamente, intorno a un sterecornice otactic per topi, in modo che tutti gli elettrodi hanno accesso al midollo spinale preparato in seguito.
   5. Collegare tubi e siringhe ai titolari elettrodi essere mela per applicare una pressione negativa.

2. Commenti generali per la sperimentazione animale e preparazione degli animali Procedura di registrazione

1. Eseguire tutti gli esperimenti con i topi secondo le direttive del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l'uso. Eseguire tutti gli interventi chirurgici e le registrazioni in anestesia profonde assicurando che la sofferenza degli animali è ridotta al minimo.
2. Anestetizzare l'animale mediante iniezione ip di ketamina / xilazina (125 mg e 8 mg per g BW di ketamina e xilazina, rispettivamente 10 ml / g di peso corporeo della soluzione preparata come descritto sopra). Se necessario, durante le registrazioni a lungo termine, ulteriori iniezioni possono essere effettuate ip o im
   Nota: ripetitivi im iniezioni di 0,05-0,1 ml di soluzione di ketamina / xylazina nelle cosce hanno dimostrato di essere adattoper mantenere l'animale in anestesia profonda fino a 3 ore.
3. Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
4. Fissare la testa dell'animale in un telaio stereotassico e utilizzare una piastra elettrica con sonda rettale e anello riflesso per controllare la temperatura corporea dell'animale durante l'esperimento. Fissazione del midollo spinale in un telaio stereotassico non è necessario.
5. Prima di iniziare la preparazione, verificare la profondità della narcosi da reflex eyeblink e contrazioni tra le dita dei topi. Riflessi dovrebbero essere aboliti.
6. Aprire la pelle lungo la linea mediana sopra il midollo spinale dal livello toracico superiore ad abbassare le zone lombari per ottenere un campo operativo chiaro con un bisturi. Non usare le forbici per fare incisioni cutanee. Perdere con cura la pelle dal tessuto sottostante. Durante le fasi successive mantengono la ferita inumidito dello 0,9% soluzione salina.
7. Tagliare tendini e tessuto connettivo su entrambi i lati delle vertebre lombari da livelli toracici usando bisturi e forbici.
8. Rimuovere i processi spinosi e resto del tessuto connettivo intorno alle vertebre con una piccola pinza.
9. Rompere con cautela vertebre con la pinza a partire dai livelli lombari (L4/L5) sotto un microscopio da dissezione. Spingere la punta della pinza nello spazio tra le vertebre e il midollo spinale e sollevare pezzi di ossa a parte. Non danneggiare la dura ed evitare una pressione al midollo spinale. Entrambi sono fondamentali per il successo. Mantenere il midollo spinale inumidito durante l'intera procedura. Procedere a livelli medio-toracici.

3. Separazione delle radici dorsali e DRP registrazione (Figura 2)

1. Aprire la dura madre con cura utilizzando un ago sottile (30 G) con una punta piegata. Utilizzare aCSF per inumidire da ora in poi.
2. Separare le radici dorsali, per quanto possibile con il calibro e tagliare due radici adiacenti come distale possibile. Vigorosa tirando le radici durante separazione colpisce il successo dell'esperimento.
3. Abbassare l'elettrodo di aspirazione verso il basso per il faiRSAL radici. Aggiungere tanto aCSF al midollo spinale possibile perché liquido aiuta a succhiare nelle radici dorsali.
4. Succhiare la fine taglio di una radice dorsale in una pipette di vetro applicando una pressione negativa attraverso una siringa. Se necessario, spostare la radice dorsale di fronte all'apertura elettrodo utilizzando un ago sottile.
5. Se la radice dorsale si trova a secco entro l'elettrodo di aspirazione, aggiungere un po 'aCSF alla sua punta, mentre con cura succhia fino a quando la pipetta è sufficientemente pieno di aCSF.
6. Dopo la radice dorsale viene aspirata, sollevare la punta dell'elettrodo dal midollo spinale. Fate attenzione che nessun "ponte acqua" tra il puntale e il midollo spinale corto circuito l'elettrodo di registrazione / stimolazione.
7. Ripetere i passaggi 3,3-3,6 per una radice adiacente omolaterale.
8. Posizionare l'elettrodo di riferimento più vicino possibile alle radici dorsali e tenerlo inumidito applicando aCSF.
9. Stabilendo la configurazione della registrazione, una radice è già scelto per la stimolazione, ilaltra per la registrazione. Aumentare la tensione di graduale durante la registrazione della seconda radice dorsale è fatto in modo pinza corrente. Si può notare una breve deviazione verso il basso che è seguita da una lenta, lunga durata deflessione verso l'alto rappresenta il DRP.
10. Regolare la tensione stimolo per sopramassimale livelli e registrare diverse scansioni (almeno 20 - 30 spazza / radice dorsale a 0.1 Hz, filtra tra 0,3 Hz-3 kHz).
11. Registrare treni corti di tre stimoli (100 Hz) per ottenere informazioni circa la sommatoria tempo-dipendente della DRP.
12. Passare la registrazione e il sito di stimolazione per ulteriori registrazioni controlaterale.
13. Animali non sono destinati a sopravvivere alla procedura. Sacrifica animali dopo l'ultima registrazione per decapitazione, mentre ancora sotto anestesia profonda (ketamina / xylazina, vedi sopra, passo 2.2).

4. Analisi dei dati

1. Trasferire i dati al programma di analisi (ad esempio Sigma Plot, Igor Pro, o MATLAB).
2. Calcola tracce medi from 20-30 spazza.
3. Prendere la massima ampiezza della deflessione tensione (rispetto al basale; DRP ampiezza di picco) per ulteriore analisi (Figura 3).
4. Calcolare il rapporto tra l'ampiezza picco DRP dopo tre impulsi e del singolo impulso per ottenere una misura della sommatoria dipendente dal tempo di potenziali successive.

Risultati

Tracce tipiche DRP sono mostrati in Figura 3. La stimolazione manufatto di rilievo è di solito seguita da una breve deviazione verso il basso. Successivamente una lenta, lunga durata deflessione verso l'alto, che rappresenta il DRP è chiaramente distinguibile. In un sottogruppo di registrazioni, i riflessi spinali sono visibili come piccole punte sulla parte superiore del DRP. In normali topi wild-type, i riflessi spinali appaiono più spesso quando la tensione è eccessiva stimolazione. Come i ri...

Discussione

Registrazioni-extra e intracellulari elettrofisiologici di attività neuronale e potenziali sinaptici in vivo sono allo stato dell'arte delle tecniche di indagine delle funzioni neuronali del sistema nervoso centrale e fisiopatologia. Integrazione spinale è fondamentale per la funzione motoria, ad esempio, il movimento degli arti e per la percezione sensoriale multimodale. Inibizione presinaptica è un meccanismo fondamentale in questo processo computazionale garantire risposte adeguate a input se...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)	Braun Melsungen AG	3570350
(Melsungen, Germany)
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamin 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30G micro needle/ Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
(Melsungen, Geramny)
Salts for aCSF	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 Dual Output Square Pulse	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
Stimulator
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster software
Data acquisition
Universal amplifier	npi (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
Micropipette puller	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
Dissecting microscope	Olympus (Tokyo, Japan)
Micromanipulator	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket System	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
Intra-/extracellular recording electrode holder	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227