מדידת השדרה Presynaptic עיכוב בעכברים על ידי הקלטה פוטנציאלית הגבי רוט<em&gt; בVivo</em

Summary

עיכוב presynaptic GABAergic הוא מנגנון מעכב חזק בחוט השדרה החשוב עבור מנוע ושילוב אות תחושתי ברשתות חוט השדרה. שלילת קוטביות מביא ראשוני בסיסית ניתן למדוד על ידי הקלטה של ​​פוטנציאל שורש הגבי (DRP). כאן אנו מדגימים שיטת רישום vivo של DRP בעכברים.

Abstract

עיכוב presynaptic הוא אחד מהמנגנונים המעכבים החזקים ביותר בחוט השדרה. המנגנון הפיזיולוגי הבסיסי הוא שלילת קוטביות של סיבים מביא העיקריים בתיווכו של סינפסות GABAergic axo-אקסון (שלילת קוטביות מביא ראשונית). כוחה של שלילת קוטביות מביא העיקרית ניתן למדוד על ידי הקלטה של ​​פוטנציאלים-נערך נפח בשורש הגבי (פוטנציאלי שורש הגבי, DRP). שינויים פתולוגיים של עיכוב סינפטי הם קריטיים בעיבוד המרכזי חריג של מצבי כאב מסוימים ובחלק מההפרעות של רגשנות יתר מוטורי. כאן, אנו מתארים שיטה של DRP ההקלטה in vivo בעכברים. הכנת שורשים הגבי בעמוד השדרה בחיה הרדים והליך הרישום באמצעות אלקטרודות יניקה מוסברות. שיטה זו מאפשרת מדידת GABAergic DRP ובכך הערכת עיכוב presynaptic השדרה בעכבר החי. בשילוב עם מודלים עכבר מהונדסים, הקלטת DRP יכול seRVE ככלי רב עוצמה כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של עמוד השדרה הקשורים למחלה. יש בvivo הקלטה מספר יתרונות בהשוואה להכנות vivo לשעבר מבודדות חוט השדרה, למשל את האפשרות של הקלטה או מניפולציה של רשתות ואינדוקציה של DRP על ידי גירוי של עצבים היקפיים supraspinal בו זמנית.

Introduction

עיכוב presynaptic הוא אחד מהמנגנונים המעכבים החזקים ביותר בחוט השדרה. זה מעכב פוטנציאלי postsynaptic מעוררים (EPSPs) בmotoneurons monosynaptically הנרגש מבלי לשנות את פוטנציאל הממברנה postsynaptic והרגישות של motoneurons ^1-3. שלילת קוטביות העיקרית מביא (PAD) הנגרמת על ידי סינפסות axo-אקסון GABAergic על גבי סיבי presynaptic חושיים היא המנגנון הבסיסי ^4-7 (ראה גם Figure1A). סינפסות אלה מכילים _GABA-B-GABA ורצפטורים (GABA R ו _GABA-B R). פעילות GABA R מובילה לעלייה במוליכות כלוריד אשר מעוררת PAD עקב חלוקת יון המקומית. לוקי שלילת קוטביות זו ההתפשטות של פוטנציאל פעולה למסופי האקסון ומפחית את כוחם מובילים לירידת Ca ^{2 +} זרם והפחתה של שחרור משדר. הפעלה של רצפטורים _GABA-B לא עושהלא לתרום לPAD אבל מוביל לירידה של Ca ^{2 +-זרם} ובכך משפר את עיכוב סינפטי. בעוד שההפעלה של GABA R נראית שמעורבת בעיכוב קצר טווח, _GABA-B R מעורב באפנון ארוך טווח ^8-10. בנוסף לGABA, המהווה חלק העיקרי של PAD ועיכוב סינפטי, מערכות משדרים אחרות שאולי גם לווסת ולתרום ^ל11,12 מנגנון זה.

נראים שינויים פתולוגיים בעיכוב presynaptic להיות מכריע בכמה מדינות מחלה למשל דלקת היקפית וכאב נוירופתי ^13,14, כמו גם עיבוד כאב המרכזי חריג ^15, פגיעה בחוט השדרה ^16, ומחלות של מערכת העצבים המרכזית עם רגשנות יתר מוטורי בתיווכו של שידור GABAergic הפגום ^{17, 18.} לפיכך, הערכת עיכוב presynaptic כדאי לחקור מצבים פתולוגיים ניסיוניים ברמת חוט השדרה in vivo . PAD מעורר פוטנציאלי נפח נערך מתן מדידה ישירה של עיכוב סינפטי בחוט השדרה. פוטנציאלים אלה נקראים פוטנציאלים הגבי שורש (DRP) וניתן למדידה משורשי הגבי בעמוד השדרה לאחר הגירוי של שורשי גב צמודים ^7.

מדידות הראשונות של DRP דווחו בחתולים וצפרדעים ¹⁹ ונחקרו באינטנסיביות בחתולים על ידי אקלס, שמידט, ואחרים בתחילת 1970s ^3,4,20,21. בעוד בvivo הקלטות של DRP בחתולים וחולדות ^{22 23} היו בשימוש נרחב, מדידות בעכברים כבר בוצעו באופן כמעט בלעדי בהכנות vivo לשעבר מבודדות חוט השדרה ^15,24. כאן, אנו מתארים שיטה להקליט DRP בעכברים מורדמים in vivo המאפשר מדידה ישירה של עיכוב סינפטי באורגניזם שלם.

Protocol

כל הליכי הניסוי שהוזכרו בפרוטוקול הבא אושרו על ידי רשויות מדינת תורינגיה (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. הכנות לניסוי

1. ייצור של אלקטרודות היניקה
   1. משוך micropipette באמצעות זכוכית נימים ורוסיליקט רגילה עם חולץ micropipette, למשל האלקטרודה תיקון סטנדרטית.
   2. בלם האלקטרודה לטיפ בקוטר של 0.5-1 מ"מ (מעט גדול יותר בקוטר של השורשים הגבי) באמצעות קובץ יהלומים.
   3. פולני חום הקצה, כך שהוא לא יפגע בשורש הגבי כאשר הוא נשאב פנימה לפיד מעבדה סטנדרטי יהיה מתאים.
   4. הר נימה הזכוכית על בעל אלקטרודה מחובר למזרק שבאמצעותו ניתן ליישם בלחץ שלילי.
2. הכנה של פתרונות
   1. 2% מערבבים 0.75 מיליליטר קטמין 10%, 0.24 מיליליטר xylazine: הרדמה בהזרקה לעכבריםnd 5 מיליליטר תמיסת מלח 0.9%. משקל גוף 10 μl / g (BW) של הפתרון להיות מוזרק intraperitoneally (IP).
   2. נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF): מדולל במים מזוקקים פעמיים מלחים הבאים (במ"מ): NaCl 134; KCl 3; KH ₂ PO ₄ 1.25; MgSO ₄ • H ₂ O _2; NaHCO ₃ 25; CaCl ₂ 2; D- גלוקוז 10. הוספת H ₂ O ₂ לריכוז סופי של 0.003%. השתמש פתרון תמיד מוכן טרי.
3. הכנה של הגדרת ההקלטה (איור 2)
   1. חברו את המגבר לממשק מחשב להפיכת קובץ לדיגיטלי נתונים.
   2. השתמש בתכנית מבוססת מחשב או טיימר אנלוגי כדי לעורר גירוי מרובע דופק ורכישת נתונים על כונן קשיח של מחשב.
   3. השתמש silverwires chlorided מחובר למחזיקי אלקטרודת זכוכית סטנדרטיים כמו לגירוי וצריבה.
   4. להרכיב שלושה מניפולטורים לגירוי, הקלטה והאלקטרודה התייחסות בהתאמה סביב stereמסגרת otactic לעכברים, כך שלכל האלקטרודות גישה לחוט השדרה מוכנה בשלב מאוחר יותר.
   5. חבר tubings ומזרקים למחזיקי אלקטרודה להיות תפוח להפעיל לחץ שלילי.

2. הערות כלליות לניסויים בבעלי חיים ובעלי החיים הכנה להקלטת נוהל

1. לבצע את כל הניסויים באמצעות עכברים על פי הנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש המתאים. לבצע את כל הניתוחים והקלטות בהרדמה עמוקה להבטיח כי הסבל של בעלי חיים הוא ממוזער.
2. להרדים את בעלי החיים על ידי הזרקת ה-IP של קטמין / xylazine (125mg ו8mg לBW גרם של קטמין ו xylazine, בהתאמה; BW 10 μl / גרם של הפתרון מוכן כפי שתואר לעיל). במידת צורך במהלך הקלטות לטווח ארוך, יכולה להתבצע זריקות נוספות IP או im
   הערה: זריקות im חוזרות ונשנות של 0.05-0.1 מיליליטר של תמיסת קטמין / xylazine בירכיים העליונות הוכיחו להיות מתאיםכדי לשמור על בעלי החיים בהרדמה עמוקה לתקופה של עד 3 שעות.
3. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
4. לתקן את הראש של החיה במסגרת stereotactic ולהשתמש בכרית חימום עם בדיקה רקטלית ולולאת הרפלקס לשלוט בטמפרטורת גוף של החיה במהלך הניסוי. קיבוע של עמוד השדרה במסגרת stereotaxic אינו הכרחי.
5. לפני שמתחיל בהכנה, לבדוק לעומק של הרדמה על ידי רפלקס הרף עין ורעד בין אצבעות רגליים של העכברים. רפלקסים יש לבטלו.
6. פתח את העור לאורך קו האמצע מעל חוט השדרה מרמת בית החזה העליונה כדי להוריד את האזורים המותני כדי לקבל שדה מבצעי ברור באמצעות אזמל. אין להשתמש במספריים כדי להפוך את החתכים בעור. משוחרר בזהירות את העור מהרקמה הבסיסית. במהלך השלבים הבאים לשמור על הפצע הטבול בתמיסת מלח 0.9%.
7. חותכים גידים ורקמות חיבור משני צידי החוליות מהמותני לרמות בית החזה באמצעות אזמל ומספריים.
8. הסר את התהליכים ושאר רקמות חיבור spinous סביב החוליות באמצעות זאטוט קטן.
9. זהירות לפצח חוליות עם הזאטוט החל מהרמות המותני (L4/L5) תחת מיקרוסקופ לנתח. לדחוף את הקצה של הזאטוט בחלל שבין החוליות וחוט השדרה והרם את חלקי עצם זה מזה. אינו פוגע בדורה ולהימנע מלחץ על חוט השדרה. שניהם הם קריטיים להצלחה. שמור על חוט השדרה הרטיב במהלך ההליך כולו. להמשיך לרמות אמצע בית החזה.

3. הפרדה של שורשים הגבי וDRP הקלטה (איור 2)

1. פתח את מאטר הדורה שימוש בזהירות מחט דקה (30 G) עם קצה מכופף. השתמש aCSF להרטבה מעתה והלאה.
2. הפרד את השורשים הגבי ככל האפשר באמצעות המד ולחתוך שני שורשים צמודים כדיסטלי ככל האפשר. נמרץ משיכת השורשים במהלך ההפרדה משפיעה על ההצלחה של הניסוי.
3. מנמיכים את האלקטרודה היניקה עד למטלותrsal שורשים. להוסיף כמה שיותר aCSF לחוט השדרה ככל האפשר, כי נוזל מסייע למצוץ בשורשים הגבי.
4. תמצוץ סוף החתך של שורש הגבי אחד לטפטפות כוס אחת על ידי הפעלת לחץ שלילי באמצעות מזרק. במידת צורך, להעביר את השורש הגבי מול פתיחת האלקטרודה באמצעות מחט עדינה.
5. אם השורש הגבי טמונה יבש בתוך האלקטרודה היניקה, להוסיף קצת aCSF לקצה שלה בזמן שמוצץ בזהירות עד שטפטף מלא מספיק עם aCSF.
6. לאחר השורש הגבי נשאב ב, להעלות את הקצה האלקטרודה מחוט השדרה. תשמור על עצמך שלא "גשר מים" בין קצה פיפטה וכבל הקצר במעגל השדרה האלקטרודה הקלטה / גירוי.
7. חזור על שלבים 3.3-3.6 לשורש סמוך ipsilateral.
8. מקם את האלקטרודה ההתייחסות הקרובה ככל האפשר לשורשים הגבי ולשמור אותו בטעימה על ידי יישום aCSF.
9. על ידי הקמת מערך ההקלטה, שורש אחד הוא כבר נבחר לגירוי,אחר להקלטה. להגדיל בשלבים מתח בעת הקלטה מהשורש הגבי השני נעשה במצב מהדק הנוכחי. אפשר להבחין בסטייה כלפי מטה קצרה ואחריו סטיה איטית, ארוך טווח כלפי מעלה מייצגת את DRP.
10. התאם את מתח הגירוי לsupramaximal רמות ולהקליט כמה מטאטא (לפחות 20-30 מטאטא / שורש הגבי ב0.1 הרץ, מסנן בין 0.3 קילוהרץ הרץ-3).
11. הקלט רכבות קצרות של שלושה גירויים (100 הרץ) כדי לקבל מידע על הסיכום של DRP תלוי הזמן.
12. לעבור הקלטה ואתר גירוי להקלטות נגדי נוספות.
13. בעלי חיים לא נועדו לשרוד את ההליך. להקריב בעלי חיים לאחר ההקלטה האחרונה על ידי עריפת ראש ועדיין תחת הרדמה עמוקה (קטמין / xylazine, ראה לעיל, צעד 2.2).

4. ניתוח נתונים

1. העבר את הנתונים לתכנית ניתוח (מגרש סיגמא למשל, איגור Pro, או MATLAB).
2. חישוב fr עקבות הממוצעאום 20-30 מטאטא.
3. קח את המשרעת המקסימלי של הסטייה המתח (מנקודת ההתחלה; המשרעת שיא DRP) לניתוח נוסף (איור 3).
4. לחשב את היחס בין המשרעת שיא DRP לאחר שלושה פולסים ודופק יחיד להשיג מידה של הסיכום התלוי בזמן של פוטנציאלים שלאחר מכן.

תוצאות

עקבות DRP טיפוסיות מוצגות באיור 3. חפץ הגירוי הבולט בדרך כלל על ידי הטיה כלפי מטה קצרה. לאחר מכן סטיה איטית, ארוך טווח כלפי מעלה, המייצגת את DRP היא להבחין בבירור. בקבוצת משנה של הקלטות, רפלקסים שורש הגבי נראים כמו קוצים קטנים בחלקו העליון של DRP. בעכברים נורמלים wild-...

Discussion

קלטות אלקטרו במיוחד ותאיות של פעילות עצבית ופוטנציאל הסינפטי in vivo הן מדינה של טכניקות אמנות בחקירת פונקציות עצביות במערכת העצבים המרכזית והפתופיזיולוגיה. שילוב של עמוד השדרה הוא קריטי לתפקוד מוטורי, כגון תנועת גפיים ולתפיסה חושית מולטי. עיכוב presynaptic הוא מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)	Braun Melsungen AG	3570350
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamine 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30 G Microneedle/ Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
Salts for aCSF	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 Dual Output Square Pulse	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster software
Universal amplifier	NPI (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
Micropipette puller	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
Dissecting microscope	Olympus (Tokyo, Japan)
Micromanipulator	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket System	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
Intra-/extracellular recording electrode holder	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227