Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

GABAerjik presinaptik inhibisyonu motor ve omurilik ağlarında duyusal sinyal entegrasyon için önemli omurilikteki güçlü bir önleyici mekanizmadır. Altta yatan primer afferent depolarizasyon dorsal kök potansiyelleri (DRP) kaydı ile ölçülebilir. Burada farelerde DRP in vivo kayıt için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Özet

Presinaptik inhibisyon omurilik en güçlü önleyici mekanizmalarından biridir. Bunun altında yatan fizyolojik mekanizma GABAerjik axo-aksonal sinaps (birincil aferent depolarizasyon) tarafından aracılık edilen primer afferent liflerin bir depolarizasyon. Birincil aferent depolarizasyon gücü dorsal kök (dorsal kök potansiyelleri, DRP), hacimli-yürütülen potansiyelleri kayıt ile ölçülebilir. Presinaptik inhibisyon patolojik değişiklikler, bazı ağrı koşullarının anormal merkezi işleme ve motor hipereksitabilitenin bazı hastalıklarda çok önemlidir. Burada, farelerde in vivo olarak kayıt DRP için bir yöntem tarif eder. , Anestezi verilen hayvanın ve emme elektrodu kullanarak kayıt prosedürü omurilik dorsal kök preparasyonu açıklanmıştır. Bu yöntem, GABAerjik DRP ölçme ve böylece canlı fare omurilik presinaptik olarak önlenmesini tahmin sağlar. Transgenik fare modelleri ile birlikte, DRP kayıt olabilir sehastalıkla ilişkili spinal patofizyolojiye araştırmak için güçlü bir araç olarak rve. in vivo kayıt örneğin eşzamanlı kayıt ya da supraspinal ağları ve periferik sinirlerin uyarılması ile DRP indüksiyon manipülasyon olasılığı ex vivo izole spinal kord hazırlıkları kıyasla birçok avantajı vardır.

Giriş

Presinaptik inhibisyon omurilik en güçlü önleyici mekanizmalarından biridir. Bu postsinaptik zar potansiyeli ve motor nöronlar 1-3 uyarılabilirliğini değiştirmeden monosynaptically heyecan motonöronları uyancı postsinaptik potansiyeller (EPSP) inhibe eder. Duyusal presinaptik liflerin üzerine GABAerjik axo-aksonal sinaps tarafından uyarılan primer afferent depolarization (PAD) altta yatan mekanizma 4-7 (ayrıca Figure1A bakınız). Bu sinapsların GABA A ve GABA B-reseptörleri (GABA A R ve GABA B R) içerir. GABA A R aktivitesi nedeniyle lokal iyon dağılımına PAD ortaya çıkarır klorür iletkenlik bir artışa yol açar. Bu depolarizasyon bloklar akson terminalleri içine aksiyon potansiyelleri yayılma ve azalmış Ca 2 lider güçlerini azaltır +-akını ve verici serbest bir azalma. GABA B reseptörlerinin aktivasyonu yok not PAD katkıda ama bu şekilde presinaptik olarak önlenmesini artırmak Ca 2 +-akışı bir azalmaya yol açar. GABA A R'nin kısa süreli aktivasyon inhibisyonu dahil olmak olmakla birlikte, GABA B R, uzun vadeli modülasyonu 8-10 katılmaktadırlar. PAD ve presinaptik inhibisyonunun önemli bir bölümünü oluşturur GABA, ek olarak, diğer vericiler sistemleri de modüle olabilir ve bu mekanizma 11,12 katkıda bulunur.

Presinaptik inhibisyon patolojik değişiklikler, kusurlu GABAerjik transmisyon 17 tarafından aracılık edilen motorlu hiper-ile-çevresel iltihap ve nöropatik ağrıya 13,14 yanı sıra anormal merkezi ağrı işlem 15, omurilik yaralanması 16, ve merkezi sinir sistemi hastalıkları, örneğin, birkaç hastalık durumu çok önemli görünmektedir 18. Böylece, presinaptik inhibisyonu tahmin in vivo omurilik düzeyinde deneysel patolojik koşulları araştırmak için faydalıdır . PAD, omurilikte presinaptik inhibisyon doğrudan bir ölçümünü sağlayan birim gerçekleştirilen potansiyellerine neden olur. Bu potansiyelleri dorsal kök potansiyelleri (DRP) olarak adlandırılır ve komşu dorsal kökler 7 uyarılmasından sonra omurilik dorsal köklerinden ölçülebilir.

DRP ilk ölçümleri kedi ve kurbağalar 19 rapor edilmiştir ve yoğun 1970'lerin başında 3,4,20,21 yılında Eccles, Schmidt ve diğerleri tarafından kedilerde çalışıldı. Kedi ve 22 farelerde 23 DRP in vivo kayıtları yaygın olarak kullanılmış olsa da, farelerde ölçümleri hemen hemen tamamen izole edilmiş ex vivo omurilik preparasyonlar 15,24 gerçekleştirilmiştir. Burada, sağlam organizmada presinaptik inhibisyon doğrudan bir ölçümünü sağlayan in vivo olarak, anestezi uygulanmış farelerde DRP kaydetmek için bir yöntem tarif eder.

Protokol

Aşağıdaki protokolde belirtilen tüm deneysel prosedürleri Thüringen devlet yetkilileri (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12) tarafından onaylanmıştır.

1.. Deney için hazırlıklar

  1. Emme elektrot İmalatı
    1. Örneğin bir standart yama elektrot bir mikropipet çektirmesi ile standart borosilikat cam kılcal kullanarak bir mikropipet çekin.
    2. Fren bir elmas dosyasını kullanarak (dorsal kökler çapından biraz daha büyük) 0.5-1 mm çaplı ucuna elektrot.
    3. Isı lehçe bu standart bir laboratuvar meşale içeri emilir zaman dorsal kök zarar olmayacak şekilde uç uygun olacaktır.
    4. Negatif basınç uygulanabilir, üzerinden bir şırıngaya bağlanmış bir elektrod tutucuya cam filament monte edin.
  2. Çözeltilerin hazırlanması
    1. Fareler için enjeksiyon anestezi: 0.75 ml ketamin 10% karıştırın, 0.24 ml% 2 ksilazin and 5 ml% 0.9 tuzlu su. Çözeltinin 10 ul / g vücut ağırlığı (BW) (ip), periton içinden enjekte edilecektir.
    2. Yapay beyin omurilik sıvısı (CSF), KCI 3, KH 2 PO 4 1.25, MgSO 4 • H2O 2, 3 25 NaHCO; CaCl2 2; D-NaCl 134: iki kere damıtılmış su içinde (mM olarak) şu tuzları seyreltin 10, glikoz. % 0.003 'lik bir son konsantrasyona kadar, H 2 O 2 ekleyin. Her zaman taze hazırlanan solüsyonu kullanın.
  3. Kayıt kurulum hazırlanması (Şekil 2)
    1. Veri sayısallaştırma için bir PC arayüzü amplifikatörü bağlayın.
    2. PC sabit disk üzerinde bir kare darbe uyarıcı ve veri toplama tetiklemek için bir PC-tabanlı bir program veya bir analog zamanlayıcı kullanın.
    3. Stimülasyon ve kayıt için standart cam elektrot sahiplerine bağlanan Tekrar klorid silverwires kullanın.
    4. Bir stere etrafında sırasıyla uyarım, kayıt ve referans elektrot için üç manipülatörler arayafareler için otactic çerçeve, tüm elektrotlar daha sonra hazırlanan omuriliğe erişimi böylece.
    5. Negatif basınç uygulamak için elma olmak üzere elektrot sahiplerine borulama ve şırınga bağlayın.

2. Hayvan Deneyleri ve Kayıt Prosedürü için Hayvan Hazırlanması için Genel Yorumlar

  1. Ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi kurallarına göre fareler kullanarak tüm deneyler. Hayvan acı minimize olmasını sağlamak derin anestezi altında ameliyat ve kayıtları gerçekleştirin.
  2. (, Yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan solüsyonu 10 ul / g BW sırasıyla 125 mg ve ketamin ve ksilazin, g başına BW ila 8 mg), ketamin / ksilazin arasında ip enjeksiyonu ile hayvan anestezisi. Uzun süreli kayıtlar sırasında Gerekirse ilave enjeksiyonlar ip veya im yapılabilir
    Not: 0,05-0,1 arasında tekrarlayan im enjekte üst uyluk ketamin / ksilazin solüsyonu uygun olduğu kanıtlanmıştırkadar, 3 saat boyunca derin anestezi hayvanı korumak için.
  3. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  4. Bir stereotaktik çerçeve içinde hayvanın baş düzeltmek ve deney sırasında hayvanın vücut sıcaklığını kontrol etmek için rektal prob ve refleks halkası olan bir ısıtma yastığı kullanın. Bir stereotaksik çerçeveye omurilik sabitleme gerekli değildir.
  5. Hazırlık başlamadan önce, farelerin ayak parmakları arasında eyeblink refleks ve seğirmesi tarafından narkoz derinliğini kontrol edin. Refleksler ortadan kaldırılmalıdır.
  6. Bir neşter kullanılarak açık bir operasyonel alanını elde etmek için bel bölgeleri alt üst torakal seviyeden omurilik üzerinde orta hat boyunca cildi açın. Cilt kesiler yapmak için makas kullanmayınız. Dikkatlice altta uzanan doku arasındaki gevşek deri. Sonraki adımlar% 0,9 tuz ile nemlendirilmiş yara tutmak sırasında.
  7. Neşter ve makas kullanırken tendonları ve torakal seviyelere lomber vertebra iki tarafında bağ dokusu kesti.
  8. Küçük bir cımbız kullanarak omurları etrafında spinöz süreçleri ve bağ dokusu dayanağını çıkarın.
  9. Dikkatlice kıskaç bir mikroskop altında lomber düzeylerde (L4/L5) başlayarak ile vertebra çatlak. Vertebra ve omurilik arasındaki boşlukta çenenin ucu kıpırdamak ve dışında kemik parçaları kaldırın. Dura zarar ve omuriliğe basınç önlemek etmeyin. Hem başarısı için kritik öneme sahiptir. Bütün işlem sırasında ıslatılmış omurilik tutun. Orta torakal seviyelere devam.

3. Sırt Kökler ve DRP Kaydı ayıran (Şekil 2)

  1. Dikkatli bir bükülmüş ucu ile ince bir iğne (30 G) kullanılarak dura mater açın. Artık nemlendirilmesi için aCSF kullanın.
  2. Ölçer kullanarak mümkün olduğunca dorsal kökleri ayırmak ve mümkün olduğunca uzak iki komşu kökleri kesmek. Güçlü ayrılması sırasında kökleri üzerinde çekme deneyi başarısını etkiler.
  3. Do emme elektrot aşağı indirinkökleri rsal. Sıvı dorsal köklerde emmek olur mümkün olduğunca omuriliğe kadar aCSF ekleyin.
  4. , Bir şırınga aracılığıyla negatif basınç uygulanarak bir cam pipet içine bir dorsal kök, kesilen ucu em. Gerekirse, ince bir iğne kullanılarak elektrot açıklığın önünde dorsal kök hareket ettirin.
  5. Dorsal kök emme elektrodu içinde kuru seyrederse pipet yeterince doldurulur aCSF kadar dikkatlice emerken, ucu için bir aCSF ekleyin.
  6. Dorsal kök emilir sonra, omurilikten elektrot ucunu yükseltmek. Özen pipet ve omurilik kısa devre kayıt / stimülasyon elektrot arasında "su köprüsü".
  7. Tekrar bir taraf bitişik kök için 3,3-3,6 adımları.
  8. Dorsal köklerine mümkün olduğunca yakın referans elektrodu yerleştirin ve aCSF uygulayarak nemli tutmak.
  9. Kayıt kurulum kurarak, bir kök önceden uyarılması için seçilir,Kayıt için. Ikinci dorsal kök kayıt mevcut kelepçe modunda yapılır iken gerilim adım adım artırın. Bir DRP temsil yavaş, uzun süreli yukarı sapma tarafından takip edilir kısa aşağı doğru eğilmeye fark edebilirsiniz.
  10. (- 0.1 Hz'de 30 süpürür / dorsal kök, 0,3 Hz-3 kHz arasında filtre en az 20) düzeyleri supramaksimal ve kaç silme kaydetmek için uyarıcı voltajını ayarlayın.
  11. DRP zaman-bağımlı toplamı hakkında bilgi almak için üç uyaranlara (100 Hz) kısa trenler kaydedin.
  12. Ek taraf kayıtlar için kayıt ve stimülasyon siteyi açın.
  13. Hayvanlar prosedür hayatta kalmak için amaçlanmamıştır. Iken hala derin anestezi altında (ketamin / ksilizin, yukarıda bakınız 2.2 adım) başı kesilerek son kayıttan sonra hayvanlar kurban.

4. Veri Analizi

  1. Analiz programı veri aktarmak (örneğin Sigma Plot, Igor Pro veya MATLAB).
  2. Ortalama izleri fr hesaplayınom 20-30 süpürür.
  3. Daha fazla analiz için (Şekil 3), (DRP tepe genlik başlangıca) Voltaj sapma maksimum genliği al.
  4. Daha sonra potansiyellerinin zamana bağlı olarak toplanır bir ölçü elde etmek için üç bakliyat ve tek bir akım sonrasında DRP zirve amplitüdünün oranını hesaplar.

Sonuçlar

Tipik DRP izleri, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Belirgin stimülasyon dışlayıcı genellikle kısa aşağıya doğru bükülmesiyle takip edilmektedir. Daha sonra DRP temsil yavaş, uzun süreli yukarı sapma, açık bir şekilde ayırt edilebilir. Kayıtların bir altkümesinde, dorsal kök refleksleri DRP üstünde küçük sivri olarak görebilir. Stimülasyon voltaj fazla olduğu zaman, normal, vahşi tip farelerde, dorsal kök reflekslerin en çok görünür. Dorsal kök refleksleri bu hazı...

Tartışmalar

In vivo nöronal aktivite ve sinaptik potansiyellerin Ekstra ve intraselüler elektrofizyolojik kayıtlar MSS nöronal fonksiyonları ve fizyopatolojisi araştıran sanat teknikleri devlet vardır. Spinal entegrasyon motor işlev, örneğin bacak hareketi ve multimodal duyusal algı için çok önemlidir. Presinaptik inhibisyon duyusal girdilerin uygun tepkiler sağlanması bu hesap işleminde bir kritik mekanizmadır. Ia lifinden üzerinde GABAerjik sinapslar PAD motonöronlann uyarılmasını engelle...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Teşekkürler

Biz yönteminin kurulması sırasında yararlı tartışmalar için Manfred Heckmann teşekkür ederim. Ayrıca, biz video üreten destek için teknik yardım ve Frank Schubert Claudia Sommer teşekkür ederim. 01EO1002 ve Jena Üniversitesi Hastanesi Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi (IZKF): iş Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF), Almanya, FKZ tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)Science Products (Hofheim, Germany)GB200F-10Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)Braun Melsungen AG 3570350
(Melsungen, Germany)
Rompun 2% (Xylazine)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamin 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)KETAMIN 10%
30G micro needle/ StericanBraun Melsungen AG 4656300
(Melsungen, Geramny)
Salts for aCSFSigma-Aldrich Diverse
S88 Dual Output Square PulseGrass Technologies (Warwick, USA)S88X
Stimulator
SIU5 RF Transformer Isolation UnitGrass Technologies (Warwick, USA)SIU-V
InstruTECH LIH 8+8HEKA (Lambrecht, Deutschland)LIH 8+8 + Patchmaster software
Data acquisition 
Universal amplifiernpi (Tamm, Deutschland)ELC-03X
Micropipette pullerSutter Instruments (Novato, USA)P-1000
Dissecting microscopeOlympus (Tokyo, Japan)
MicromanipulatorSutter Instruments (Novato, USA)MPC-200/MPC-325Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket SystemStoelting (Wood Dale, USA)50300V
Intra-/extracellular recording electrode holderHarvard Apparatus (Holliston, USA)641227

Referanslar

  1. Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
  2. Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
  3. Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
  4. Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
  5. Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
  6. Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
  7. Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
  8. Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
  9. Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
  10. Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
  11. Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
  12. Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
  13. Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
  14. Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
  15. Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
  16. Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
  17. Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
  18. Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
  19. Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
  20. Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
  21. Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
  22. Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
  23. Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
  24. Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 85Merkezi Sinir Sistemi Hastal klarOmurilik Hastal klarElektrofizyolojidorsal k k potansiyelleri DRPspinal kordGABApresinaptik inhibisyonprimer afferent depolarizasyon PADIn vivo Elektrofizyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır