АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

ГАМКергических пресинаптического торможения является мощным ингибирующим механизм в спинном мозге важной для двигателя и интеграции сенсорного сигнала в спинного мозга сетей. Базовая первичных афферентных деполяризация может быть измерена путем записи дорзальных корешков потенциалов (DRP). Здесь мы показываем, способ записи в естественных условиях DRP у мышей.

Аннотация

Пресинаптического торможения является одним из самых мощных тормозных механизмов в спинном мозге. Основной физиологический механизм является деполяризация первичных афферентных волокон, опосредованных GABAergic аксо-аксонов синапсов (первичных афферентных деполяризации). Сила первичных афферентных деполяризации может быть измерена путем записи объемных потенциалов-проведены на задних корешков (задних корешков потенциалы, DRP). Патологические изменения пресинаптического торможения имеют решающее значение в ненормальном центральной обработки определенных условиях боли и при некоторых нарушениях двигательной возбудимости. Здесь мы описываем метод записи DRP в естественных условиях у мышей. Подготовка спинного мозга спинной корни в анестезированной животных и процедуры записи, используя всасывающие электроды объясняются. Этот метод позволяет измерять GABAergic DRP и тем самым оценки спинного пресинаптического торможения в живом мыши. В сочетании с трансгенных мышиных моделях, DRP съемка может себеRvE в качестве мощного инструмента для расследования связанных с заболеванием спинного патофизиологии. В естественных условиях записи имеет ряд преимуществ по сравнению с бывшими естественных условиях изолированных препаратов спинного мозга, например возможностью одновременной записи или манипуляции супраспинальных сетей и индукции DRP путем стимуляции периферических нервов.

Введение

Пресинаптического торможения является одним из самых мощных тормозных механизмов в спинном мозге. Он подавляет возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) в моносинаптически возбужденных мотонейронов без изменения постсинаптическую мембранный потенциал и возбудимость мотонейронов 1-3. Первичная деполяризации афферентных (PAD), индуцированный GABAergic аксо-аксонов синапсов на сенсорных пресинаптических волокон является основной механизм 4-7 (см. также Figure1a). Эти синапсы содержат ГАМК-и ГАМК B-рецепторы (ГАМК R и ГАМК B R). ГАМК R активность приводит к увеличению хлоридной проводимости, вырабатывающий PAD связи с локальным распределением ионов. Эта деполяризация блокирует распространение потенциалов действия в аксонов и снижает их прочность приводит к снижению Ca 2 +-приток и сокращение выпуска передатчика. Активация ГАМК B рецепторами делает нетт способствовать PAD но приводит к снижению Са 2 +-притока тем самым повышая пресинаптического торможения. В то время как активация ГАМК A R-видимому, участвует в короткий срок торможения, ГАМК B R участвуют в долгосрочной модуляции 8-10. В дополнение к ГАМК, на долю которого приходится большая часть PAD и пресинаптического торможения, другие системы передатчики могут также модулировать и свой ​​вклад в этот механизм 11,12.

Патологические изменения в пресинаптического торможения, кажется, решающее значение в нескольких болезненных состояний, например, периферийное воспаление и нейропатической боли 13,14, а также аномальные обработку центральный болевой 15, травмы спинного мозга 16 и поражение ЦНС с моторной возбудимости посредничестве дефектной передачи ГАМКергической 17, 18. Таким образом, оценивая пресинаптического торможения стоит исследовать экспериментальные патологических состояний на уровне спинного мозга в естественных условиях . PAD приводит к объемных потенциалов, обеспечивающих проведено прямое измерение пресинаптической торможения в спинном мозге. Эти потенциалы называются заднекорешковых потенциалов (DRP) и может быть измерена с спинномозговых корешков шнур спинных после стимуляции соседних спинной корни 7.

Первые измерения DRP были зарегистрированы в кошек и лягушек 19 и интенсивно изучались в кошках по Эклс, Шмидта и др. в начале 1970-х годов 3,4,20,21. В то время как естественных условиях записи в DRP из 22 кошек и крыс 23 широко используются измерения на мышах были почти исключительно выполнены в Экс Vivo изолированных препаратах спинного мозга 15,24. Здесь мы опишем метод для записи DRP под наркозом мышей в естественных условиях, позволяя прямое измерение пресинаптического торможения в здоровом организме.

протокол

Все экспериментальные процедуры, упомянутые в следующей методике были одобрены Тюрингии государственной власти (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. Подготовка к эксперименту

  1. Изготовление всасывающих электродов
    1. Потяните микропипетки с использованием стандартного боросиликатного стеклянный капилляр с микропипетки съемник, например стандартный патч электрода.
    2. Электрод до кончика диаметром 0,5-1 мм (чуть больше диаметра задних корешков) с использованием файла алмазного тормозной.
    3. Тепло польский кончик, чтобы он не повредит корни спинной когда она всасывается дюйма стандартного лабораторного факел будет подходящим.
    4. Установите стеклянную нить на держатель электрода, соединенного с помощью шприца, через которую отрицательное давление может быть применен.
  2. Приготовление растворов
    1. Инъекции анестезия для мышей: Смешайте 0,75 мл кетамина 10%, 0,24 мл ксилазина 2%й 5 мл 0,9% физиологического раствора. 10 мкл / г веса тела (BW) раствора будет вводили внутрибрюшинно (IP).
    2. Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF): Развести в дважды дистиллированной воде следующие соли (в мм): NaCl 134; KCl 3; KH 2 PO 4 1,25; MgSO 4 • H 2 O 2; NaHCO 3 25; CaCl 2 2, D- глюкозу 10. Добавить H 2 O 2 в конечной концентрации 0,003%. Используйте всегда свежеприготовленный раствор.
  3. Подготовка установки записи (рис. 2)
    1. Подключите усилитель к ПК интерфейс для оцифровки данных.
    2. Используйте программу на базе ПК или аналоговый таймер, чтобы вызвать квадратного стимулятор импульса и сбора данных на жесткий диск ПК.
    3. Используйте хлорированном silverwires, связанные со стандартными держателями стеклянный электрод, как для стимуляции и записи.
    4. Соберите три манипуляторов для стимуляции, регистрации и электродом сравнения соответственно вокруг стерotactic рама для мышей, так что все электроды имеют доступ к подготовленной спинного мозга в дальнейшем.
    5. Подключите шланги и шприцы перед держателями электродов быть яблоко применять отрицательное давление.

2. Общие комментарии к экспериментам на животных и подготовка животных для процедуры записи

  1. Выполните все эксперименты на мышах в соответствии с указаниями соответствующего институционального уходу и использованию животных комитета. Выполните все операции и записи под глубокими анестезии гарантируя, что животное страдание сведено к минимуму.
  2. Обезболить животное по внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (125 мг и 8 мг на г веса тела кетамина и ксилазина, соответственно, 10 мкл / г BW приготовленного раствора, как описано выше). При необходимости во время долговременной записи, дополнительные инъекции могут быть сделаны IP или внутримышечно
    Примечание: повторяющихся м инъекций 0,05-0,1 мл кетамина / ксилазина раствора в верхней части бедер оказались подходитдержать животное в глубокой анестезии до 3 часов.
  3. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
  4. Закрепите голову животного в стереотаксической рамки и использовать грелку с ректального зонда и рефлекторной петли контролировать температуру тела животного во время эксперимента. Фиксация спинного мозга в стереотаксической рамы не является необходимым.
  5. Перед началом подготовки, проверить глубину наркоза по ока рефлекса и подергивание между пальцами мышей. Рефлексы, должны быть отменены.
  6. Откройте кожу вдоль выше спинного мозга от верхней грудном уровне, чтобы снизить поясничного области, чтобы получить четкое оперативное поле с помощью скальпеля средней линии. Не используйте ножницы, чтобы сделать разрезов кожи. Осторожно освободить кожу от подлежащих тканей. Во последующие шаги держать рану смоченной в 0,9% растворе.
  7. Вырезать сухожилия и соединительная ткань по обе стороны от позвонков от поясничного до грудном уровнях, используя скальпель и ножницы.
  8. Удалите остистых отростков и остальную часть соединительной ткани вокруг позвонков с помощью небольшого щипцы.
  9. Тщательно трещины позвонков с щипцы, начиная с уровня поясничных (L4/L5) при вскрытии микроскопом. Shove кончик кусачками в пространстве между позвонками и спинного мозга и поднимите кости частей друг от друга. Не навреди твердую мозговую оболочку и избежать давления на спинной мозг. Оба имеют решающее значение для успеха. Держите спинной мозг, смоченной в течение всей процедуры. Перейдите к середине грудной уровнях.

3. Разделение задних корешков и DRP записи (рис. 2)

  1. Открытый твердую мозговую оболочку тщательно с использованием тонкой иглы (30 г) с загнутым кончиком. Используйте ACSF для увлажнения с этого момента.
  2. Отдельные задних корешков, насколько это возможно с помощью манометра и сократить две соседние корни, дистальный насколько это возможно. Энергичный потянув на корнях в процессе разделения влияет на успех эксперимента.
  3. Опустить всасывающий электрод до делrsal корни. Добавить столько ACSF к спинному мозгу, как это возможно, потому что жидкость помогает сосать в задних корешков.
  4. Suck обрезанный конец одного корня спинного в один стеклянных пипеток, применяя отрицательное давление через шприц. При необходимости переместить корень спинной перед открытием электрода с использованием тонкой иглы.
  5. Если корень спинной лежит сухой в течение всасывающего электрода, добавьте немного ACSF в его конце, тщательно сосать, пока пипетка не достаточно наполнен ACSF.
  6. После того, как корень спинной всасывается, повышение кончик электрода из спинного мозга. Следите за тем, нет "воды мостом" между наконечником пипетки и спинного мозга короткого замыкания записи / стимуляция электрода.
  7. Повторите шаги 3.3-3.6 для ипсилатеральный прилегающей корня.
  8. Расположите электрод как можно ближе к задних корешков и держать его увлажняют, применяя ACSF.
  9. Устанавливая настройки записи, один корень уже выбран для стимуляции,другой для записи. Увеличение напряжения ступенчато во время записи со второго корня спинного делается в текущем режиме зажим. Один может быть заметна вниз отклонения которая сопровождается медленным, длительный вверх отклонения представляющего DRP.
  10. Настройте напряжение стимул к сверхмаксимальном уровни и записать несколько зачисток (по крайней мере 20 - 30 метет / коренных спинной на 0,1 Гц, фильтр от 0,3 Гц-3 кГц).
  11. Запишите короткие поезда трех раздражителей (100 Гц), чтобы получить информацию о нестационарной суммирования DRP.
  12. Переключение записи и стимуляции сайт для дополнительных контралатеральных записей.
  13. Животные не предназначены, чтобы выжить процедуру. Жертвоприношение животных после последней записи путем обезглавливания в то же время под глубоким наркозом (кетамин / ксилазина, см. выше, шаг 2,2).

4. Анализ данных

  1. Передача данных на программы анализа (например, Sigma земля, Игорь Pro, или MATLAB).
  2. Рассчитать средние следы фрOM 20-30 метет.
  3. Возьмем максимальную амплитуду прогиба напряжения (по сравнению с исходным; DRP пик амплитуды) для дальнейшего анализа (рис. 3).
  4. Рассчитать отношение DRP пиковой амплитуды после трех импульсов и одного импульса, чтобы получить меру зависящей от времени суммирования последующих потенциалов.

Результаты

Типичные DRP следы показано на рисунке 3. Известный стимуляция артефакт обычно сопровождается короткой вниз отклонения. После этого медленно, долговечный вверх отклонение, представляющее DRP явно отличается. В подгруппе записей, заднекорешковых рефлексы могут видеть, как малые ...

Обсуждение

Дополнительные-и внутриклеточных электрофизиологических записи нейронной активности и синаптических потенциалов в естественных условиях являются состояние техники искусства в расследовании функции нейронов ЦНС и патофизиологии. Спинной интеграция имеет решающее значение дл...

Раскрытие информации

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Манфред Heckmann за полезные обсуждения в ходе создания метода. Кроме того, мы благодарим Клаудию Sommer для оказания технической помощи и Фрэнк Шуберт для поддержки производства видео. Работа выполнена при поддержке Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF), Германии, ФКЗ: 01EO1002 и Междисциплинарного Центра клинических исследований (IZKF) Йенского университета больнице.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm)Science Products (Hofheim, Germany)GB200F-10Other glass tubing might also be suitable
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl)Braun Melsungen AG 3570350
(Melsungen, Germany)
Rompun 2% (Xylazine)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
Ketamin 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)KETAMIN 10%
30G micro needle/ StericanBraun Melsungen AG 4656300
(Melsungen, Geramny)
Salts for aCSFSigma-Aldrich Diverse
S88 Dual Output Square PulseGrass Technologies (Warwick, USA)S88X
Stimulator
SIU5 RF Transformer Isolation UnitGrass Technologies (Warwick, USA)SIU-V
InstruTECH LIH 8+8HEKA (Lambrecht, Deutschland)LIH 8+8 + Patchmaster software
Data acquisition 
Universal amplifiernpi (Tamm, Deutschland)ELC-03X
Micropipette pullerSutter Instruments (Novato, USA)P-1000
Dissecting microscopeOlympus (Tokyo, Japan)
MicromanipulatorSutter Instruments (Novato, USA)MPC-200/MPC-325Mechanical micromanipulators also possible
Homeothermic Blanket SystemStoelting (Wood Dale, USA)50300V
Intra-/extracellular recording electrode holderHarvard Apparatus (Holliston, USA)641227

Ссылки

  1. Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
  2. Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
  3. Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
  4. Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
  5. Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
  6. Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
  7. Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
  8. Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
  9. Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
  10. Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
  11. Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
  12. Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
  13. Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
  14. Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
  15. Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
  16. Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
  17. Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
  18. Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
  19. Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
  20. Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
  21. Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
  22. Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
  23. Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
  24. Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

85DRPPAD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены