في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة

Summary

تم تصميم هذا البروتوكول لإظهار طريقة التعرض للثقافات الخلية لاستنشاق المواد الكيميائية السامة. تعرض متباينة واجهة الهواء السائل (علي) الثقافات من الخلايا الظهارية الهوائية يوفر نموذجا فريدا للتعرض الشعب الهوائية للغازات السامة مثل الكلور. في هذا المخطوط وصفنا تأثير استنشاق الكلور على الثقافات واجهة الهواء السائل من الخلايا الظهارية والثقافة المغمور من العضلية. في المختبر أنظمة التعرض تسمح الآلية الدراسات الهامة لتقييم المسارات التي يمكن عندئذ أن تستخدم لتطوير العوامل العلاجية الرواية.

Abstract

مزارع الخلايا لا غنى عنها لتطوير ودراسة فعالية العوامل العلاجية، وذلك قبل استخدامها في النماذج الحيوانية. لدينا قدرة فريدة لنموذج خلايا ظهارة الهوائية الإنسان وعضلة القلب متباينة بشكل جيد. هذا يمكن أن يكون أداة لا تقدر بثمن لدراسة الآثار الضارة للمواد الكيميائية السامة المستنشقة، مثل الكلور، التي يمكن أن تتفاعل عادة مع أسطح الخلايا، وشكل مختلف منتجاته على التفاعل مع المياه، والحد من آثارها في الثقافات المغمورة. لدينا نموذج باستخدام متباينة بشكل جيد الثقافات الخلايا الظهارية البشرية الهوائية في واجهة الهواء liqiuid تلتف هذا القيد وكذلك توفر فرصة لتقييم آليات حاسمة من سمية المواد الكيميائية السامة المستنشقة المحتملة. نحن تصف خسارة تعزيز النزاهة الغشاء، وإطلاق سراح كاسباس والموت على استنشاق مادة كيميائية سامة مثل التعرض الكلور. في هذه المقالة، فإننا نقترح أساليب لنمذجة التعرض الكلور في قلب الثدييات والهوائية الظهارية جأذرع في الثقافة واختبارات بسيطة لتقييم تأثيرها على أنواع الخلايا هذه.

Introduction

التعرض للمواد الكيميائية السامة المستنشقة (التشنجات اللاإرادية) / غازات مثل الكلور (الكلورين ₂₎ لا يزال مصدر قلق الصحية الجارية في التعرض العرضي وكذلك في استخدام إمكاناتها كعامل تهديد الكيميائية. على الرغم من أن الرئتين هي الهدف الأساسي، وأجهزة مثل القلب والدماغ التي تتأثر أيضا ^1-3. تستخدم في الجسم الحي عموما نماذج لاختبار سمية من التشنجات اللاإرادية، ولكن في فحوصات المختبر لتقييم سمية هي أبسط وأسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة. و تسمح المختبر النماذج أيضا للتحقيق واسعة من التفاعلات خلية العامل الذي قد يكون من الصعب تقييم في الجسم الحي. مثل هذه النظم في المختبر التعرض نادرة وعلاوة على ذلك، في بعض النماذج التقليدية حيث يتم إضافة المواد السامة إلى مستنبت في الخلايا التي يتم المغمورة، خصائص وكلاء يمكن أن تتغير بسبب التفاعلات وملزمة للمكونات في المتوسط. في سيناريوهات مثل هذه الأنظمة ثقافة الخلية مثل واجهة الهواء السائل (ALI) الثقافات من الخلايا الأولية الظهارية البشرية الهوائية، المقترح هنا، التي يمكن أن يتعرض مباشرة إلى وكلاء الغازية يمكن أن تكون واعدة.

الخلايا الظهارية المبطنة لمجرى الهواء هي خطوط الدفاع الأول ضد استنشاق المواد الكيميائية السامة. ظهارة الهوائية الإنسان يشكل حاجز مادي بين التجويف والخلايا الكامنة في الرئة ويشارك في استجابة الرئة. وتنتج عددا من السيتوكينات وغيرها من العوامل المؤيدة والمضادة للالتهابات، وكذلك تفرز المخاط السائل سطح / الهوائية (ASL) تغطي الظهارة. واحدة من القيود التقليدية في أنظمة غارقة في الثقافة المختبر هو أيضا أن ASL والمخاط التي تغطي سطح الظهارية تتم إزالة أو المخفف. هذا لا يعكس حالة فسيولوجية من الرئة الخلايا الظهارية التي تتعرض للهواء. وبالتالي، ينبغي مثالية في نظام المختبر لاختبار السمية TIC تكرار هذه العمارة. هناك مصلحة كبيرة في تطوير الفحص السريع مethods التي تتنبأ سمية الجسم الحي. الخلايا الظهارية نمت في ALI تمييز ولها هياكل ووظائف متباينة جيدا مقارنة مع الخلايا المزروعة المغمورة ويخدم نموذجا متفوقة في الشعب الهوائية.

في هذه الدراسة، ونحن تصف استخدام الثقافة الهواء السائل واجهة من مجرى الهواء الإنسان (الرغامية القصبية) الخلايا الظهارية لاختبار سمية الغاز السامة المستنشقة ومقارنتها مع ثقافة الخلية المغمور من cardiomyocyte، وبالتالي دراسة هدف هام آخر من السمية.

Protocol

1. الثقافات الجرذ Cardiomyocyte

1. أجريت جميع التجارب في إطار البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية، IACUC.
2. الحصول العضلية الفئران من قلوب (البطينين) من ذكور الفئران (240-260 ز) باستخدام الأساليب المذكورة سابقا ^4. لفترة وجيزة، تخدير الحيوانات باستخدام حقنة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (100 ملغ / كغ؛ تأكيد التخدير عن طريق قرصة أخمص القدمين طريقة) ثم قم بإزالة القلوب إلى 10.0 مل، 1 ملم كا ^{2 +} التي تحتوي على كريبس قارع الأجراس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4.
3. شطف قلوب 5-6X لإزالة الدم ومن ثم التبديل إلى كا ^{2 +} خالية العازلة كريبس قارع الأجراس التي تحتوي على 0.02٪ و 0.06٪ البروتيني كولاجيناز A (5.0 مل / القلب). احتضان القلوب في هذا الحل لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز في بعض الأحيان.
4. بعد 10-15 دقيقة، تغسل الحل الأنزيمية مع كا ^{2 +} خالية العازلة كريبس قارع الأجراس لمدة 5 دقائق إضافية. الافراج عن الخلايا من الأنسجة مترهلة بناجي ماصة 25 مل من قبل pipetting تعليق صعودا وهبوطا عدة مرات.
5. فصل الخلايا من الأنسجة من خلال تصفية 70 ميكرومتر من خلال شبكة من النايلون والسماح لهم بالاستيطان في كريبس قارع الأجراس العازلة التي تحتوي على 0.1 ملي كا ^{2 +.} تعليق بيليه خلية في 1.0 مل كريبس قارع الأجراس العازلة التي تحتوي على 0.2 ملي كا ^{2 +.}
6. طبقة بعناية على 5.0 مل من 60 ميكروغرام / مل ألبومين المصل البقري، BSA، في 15 مل أنابيب الطرد المركزي، لفصل العضلية من nonmyocytes والسماح لهم لتسوية لمدة 30 دقيقة. والعضلية هي أثقل والانتقال إلى الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية الخلايا طاف وسائل الإعلام. كرر هذه الخطوة مرة واحدة لمزيد من تنقية الخلايا.
7. الانتقال تدريجيا عن طريق الغسيل (في الخطوات باستخدام 0.25 ملي، 0.5 ملي، 0.75 ملم، و 1.0 ملي كا ^{2 +} التي تحتوي على المخزن المؤقت) على myocytes البطين / العضلية إلى 1.0 ملي كا ^{2 +} التي تحتوي على العازلة ومعلق في الإنجاز والإبداع المتوسطة التي تتكون من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة ، DMEM containiنانوغرام 2 ملغ / مل BSA، 2 مم L-الكارنيتين، 5 ملي الكرياتين، 5 ملي التورين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
8. لوحة والعضلية في الإنجاز والإبداع في مناطق ذات كثافة متوسطة من 100 إلى 150 خلية / ملم ² على 100 ​​مم أو 35 مم laminin المغلفة الأطباق ثقافة البلاستيك أو 40 × 22 مم coverslips الزجاج precoated مع laminin (1 ميكروغرام / سم ^2). بعد 1 ساعة، وغسل الأطباق مع 2.0 مل الإنجاز والإبداع لإزالة الخلايا التي لا تعلق. إضافة 10.0 مل من وسائل الإعلام الجديدة واحتضان الخلايا.

2. المتباينة واجهة الهواء السائل (علي) ثقافة الخلايا الظهارية البشرية مجرى الهواء بصل

1. شراء الأنسجة الرغامية القصبية الإنسان من الأمراض القومي للبحوث في إطار تبادل وافق مجلس المراجعة المؤسساتي البروتوكولات. حصاد الخلايا وتؤدي الثقافة باستخدام ^5،6 الإجراء المنشورة. يستخدم هذا الإجراء الثقافات الخلية كما هي نموذج دقيق لمخاطر استنشاق الإنسان للالتشنجات اللاإرادية، ومع ذلك، إذا لزم الأمر يمكن للمرء أن عزل وتنمو في ALI مواستخدام و / أو الخلايا الظهارية الهوائية الفئران ^7،8.
2. لفترة وجيزة، وجعل قطع صغيرة (~ ¼ بوصة) من الأنسجة بعد إزالة جميع الأنسجة والغدد الليمفاوية الضام. غسل الأنسجة عدة مرات في حل أفرز اللبن قارع الأجراس. إضافة إلى أنسجة أنبوب 50 مل المخروطية وإضافة حل البروتيني (1٪ Protease/0.01٪ في الحد الأدنى من وسائل الإعلام الدناز الأساسية، MEM، الأنسجة إلى نسبة السوائل (1:10)).
3. موسيقى الروك في الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة ليلة وضحاها. إنهاء تفكك الأنسجة بإضافة 10٪ مصل بقري جنيني. كشط سطح الظهارية مع مشرط الجراحة وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (2،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة).
4. خلايا لوحة في مرور واحد على snapwells المغلفة الكولاجين في المتوسطة الخاصة ALI أعد كما هو موضح بالتفصيل من قبل فوشيه وآخرون ^9. الثقافة لمدة 5 أيام قبل تغيير إلى واجهة الهواء السائل (علي) عن طريق إزالة وسائل الإعلام القمي.
5. تغذية الخلايا باستخدام وسائل الإعلام ALI كل يوم المناوبين وتسمح للخلايا التفريق لمدة 2-3 أسابيع إضافية (نلاحظ العديد من أهداب الضرب وإفراز المخاط) قبل تنفيذ التعرض. يغسل السطح القمي مع برنامج تلفزيوني الدافئة جنبا إلى جنب مع التغييرات الوسائط.

3. التعرض للكلور

1. تحتوي على نظام التعرض الكلور (CES) داخل غطاء الكيميائية المؤهلين مع سرعة وجه التشغيلية 100 التيار الوطني الحر الذي يوفر الاحتواء الثانوية اللازمة لمنع التعرض للموظفين في حال تسرب الكلور عرضي.
2. تشغيل النظام تحت ضغط إيجابي طفيف (0.5 بوصة من الماء). ويتم تغذية الهواء الجاف في 15 لتر / دقيقة وعلى مستوى مناسب من يتغذى الكلور لبلوغ تركيز الكلور النهائي المطلوب. غرف لديها غطاء تأمين مع 4 أقفال BCU صغيرة ومنخفضة durometer سيليكون طوقا لتوفير ختم الضغط.
3. تقديم خليط الكلور من _{2 إلى} وحدة تحكم كتلة تدفق. يستخدم CES اسطوانة غاز مضغوط يحتوي على 1.0٪ كلور ₂ في النيتروجين الجاف.
4. تنظيم تدفق الهواء التخفيف باستخداممصممة خصيصا لوحة التحكم وبالمثل تنظيم تركيز الكلورين ₂ تسليمها إلى غرف التعرض. وانخفاض حجم مضخة أخذ العينات تسحب العادم من الغرف إلى محلل الكلور لرصد تركيزات التي يتم ثم تسجيلها على مسجل بيانات متصلة محلل.
5. قياس معدلات التدفق داخل غرف قبل التعرض باستخدام تدفق متر لضمان المساواة في معدلات التسليم والعادم.
6. إعداد مزارع الخلايا للتعرض عن طريق إزالة وسائل الإعلام طاف وإضافة وسائل الإعلام الجديدة (الإعلام basolateral في الثقافات ALI). أي المعالجة المسبقة مع وكلاء يمكن أن يؤديها في هذا الوقت.
7. فضح الثقافات ALI من الخلايا الظهارية مجرى الهواء إلى الكلور غاز ₂ (50، 100، 300 جزء في المليون أو لمدة 30 دقيقة) في اثنين من مختومة غرف polysulfone الاحتواء البيولوجي. يتعرض العضلية (المغمورة أو متموجة الثقافات على الأغشية) إلى 50 أو 100 جزء في المليون الكلورين ₂ لمدة 15 دقيقة.
8. بعد التعرض تدفق غرف مع الهواء حتى Cيقع مستوى ل ₂ أقل من 1 جزء في المليون ويمكن فتح بأمان لإزالة الخلايا (خلال 5 دقائق).

4. المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER) قياس

1. قياس TER من الهواء السائل واجهة، ALI والثقافات باستخدام voltohmmeter الظهارية مع زوج من كلوريد الفضة الأقطاب "عود".
2. يوازن القطب عود في دقيقة وسائل الإعلام ALI 15 قبل الاستخدام.
3. إضافة وسائط الحارة للقمي (1.0 مل) وbasolateral (2.0 مل) السطح وقياس TER باستخدام أقطاب عود من voltohmmeter.
4. تراجع الذراع أقصر من القطب في وسائل الإعلام القمي والذراع يعد في وسائل الإعلام basolateral. انقر على زر 'التدبير' على voltohmmeter لتقييم المقاومة الكهربائية.
5. وvoltohmmeter لديه خيار لقياس أوم أوم أو ك. طرح المقاومة عبر دعم ثقافة خالية من الخلايا من المقاومة تقاس عبر كل طبقة الخلايا لانتاج العابرالمقاومة الظهارية (TER).

5. قياس كاسباس

1. إضافة وسائط جديدة ALI (2.0 مل) إلى سطح basolateral التعرض آخر واحتضان الخلية في درجة حرارة الغرفة. جمع وسائل الإعلام طاف في 4 و 24 ساعة.
2. قياس كاسباس 3/7 النشاط في supernatants وسائل الإعلام باستخدام كاسباس التجارية 3/7 طقم الفحص.

6. وصمة عار الغربية وكيمياء سيتولوجية مناعية

1. أداء البقع الغربية باستخدام لست] خلية كما هو موضح سابقا ^10. تعليق المحللة البروتين (20 ميكروغرام) في خفض 5X العازلة عينة وتغلى لمدة 5 دقائق. إخضاع المحللة البروتين لSDS-PAGE (4-15٪) ونقل البروتينات فصلها لغشاء النيتروسليلوز بواسطة النشاف الكهربي.
2. منع غير محددة وملزمة من قبل احتضان الغشاء مع الحليب 5٪ في غسل العازلة (PBS + المنظفات 0.1٪) وتحقيق في الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية ضد SERCA2 أو الأكتين الساركومير في 1:1،000 التخفيف، وبين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. المقبل، وغسل واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة البيروكسيداز مترافق منها الثانوي وتطوير للكشف كما هو موضح قبل ¹⁰ باستخدام التجارية البيروكسيديز كشف عدة.
3. لكيمياء سيتولوجية مناعية علاج الخلايا الحية نمت على إدراج أو coverslips الزجاج في 6 لوحات جيدة مع 0.4٪ تريتون-X-100 في 10 ملي العازلة سيترات الصوديوم لمدة 20 دقيقة بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني.
4. كتلة غير محددة ملزمة عن طريق علاج الخلايا مع 5٪ مصل حمار لمدة 20 دقيقة، ثم احتضان الخلايا مع مفتش غير محددة أو الأجسام المضادة الأولية الفردية محددة لالأكتين الساركومير أو كي 67.
5. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري، مترافق للكشف عن الأجسام المضادة الأولية وصمة عار النووية (1 ميكروغرام / مل دابي).
6. يغسل مع برنامج تلفزيوني وجبل coverslips باستخدام وسائل الإعلام التجارية في تصاعد مستمر.
7. تصور تلطيخ باستخدام المجهر الفلورسنت.

النتائج

قضيب على شكل العضلية الأولية نعلق على المصفوفات laminin وانتشر وتفرق في الثقافات متموجة (1A الشكل وأقحم فيها). وتميزت هذه الخلايا مزيد على أساس الأكتين الساركومير وSERCA2 التعبير (الأرقام 1B و 1C). العضلية الفئران هي عرضة للسمية الكلور إلى 15 دقيقة من...

Discussion

النوع الاكثر شيوعا من التعرض السامة الحادة يحدث عند واحد يتنفس مادة كيميائية سامة إلى الرئتين. ويمكن أيضا أن تؤخذ هذه المواد الكيميائية بسرعة في مجرى الدم ويمكن أن تؤثر الأجهزة الأخرى مثل الدماغ والقلب. يتم دراسة سمية استنشاق كلاء المختلفة باستخدام نماذج حيوانية وع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ