对于中吸入有毒化学测试体外细胞培养模型

摘要

此协议的目的是证明细胞培养物对吸入有毒化学品的曝光方法。曝光的区别空气 - 液体界面的气道上皮细胞（ALI）的培养物提供了呼吸道暴露于有毒气体，如氯气的独特模式。在这个手稿，我们描述对上皮细胞的气-液界面培养氯曝光和心肌细胞的液体培养的效果。 体外曝光系统允许重要机理研究，以评估，然 ​​后可以用于开发新的治疗剂的途径。

摘要

细胞培养是必不可少的开发和研究治疗药物，其在动物模型中使用前药效。我们的模型以及分化的人类气道上皮细胞和心脏肌肉细胞的独特能力。这可能是非常有用的工具来研究的毒性吸入的化学物质，如氯，可以通常与细胞表面相互作用，并且在与水反应，并限制了它们在液态培养的影响形成的各种副产物的有害影响。采用高分化人支气管上皮细胞培养在空中liqiuid接口我们的模型绕过这个限制，以及提供了一个机会，以评估潜在的有毒化学物质吸入毒性的关键机制。我们描述了增强的损失细胞膜的完整性，一旦吸入有毒化学蛋白酶的释放和死亡，如氯曝光。在这篇文章中，我们提出的方法氯气暴露在哺乳动物心脏和呼吸道上皮C型号英语学习者的文化和简单的测试，以评估其对这些细胞类型的影响。

引言

接触有毒化学物质吸入（国际信托）/气体如氯（Cl _2）保持在意外风险，以及在其作为化学威胁代理可能使用一个持续的健康问题。虽然肺是主要的目标，器官，如心脏和大脑也受到影响^1-3。 体内模型通常用于从国际信托测试毒性，但在体外实验进行毒性评估更简单，更快速，更具成本效益。 在体外模型还允许对可能难以在体内评估代理-细胞相互作用广泛的调查。这种体外曝光系统是罕见的，而且，在有毒物质被添加到其中的细胞被淹没培养基某些常规型号，代理商的属性可以改变由于相互作用和结合的培养基成分。在这样的情况下的细胞培养系统，例如气 - 液界面（ALI人原代气道上皮细胞，在这里提出，可直接暴露于气态试剂的）培养物可能是有希望的。

上皮细胞衬里的气道是抵御吸入有毒化学品的第一线。人类气道上皮细胞形成在肺中的腔管和相关的细胞之间的物理屏障，并参与肺的响应。它产生的许多细胞因子和其他亲和抗炎剂，以及分泌粘液/气道表面液体（ASL）覆盖的上皮。一个在常规浸没在体外培养系统中的限制也是覆盖上皮表面ASL和粘液除去或稀释。这并不反映被暴露在空气中的肺上皮细胞的生理条件。因此， 在体外系统的理想旅游业议会毒性试验应重复这种架构。目前在开发快速筛选米的极大兴趣ethods的预测体内毒性。在ALI生长上皮细胞分化并具有分化良好的结构和功能相比，细胞生长淹没和服务于呼吸道的卓越典范。

在这项研究中，我们描述了使用人的气道（支气管）上皮细胞，用于测试有毒气体吸入毒性气 - 液界面培养物，并将其与心肌细胞的浸没式细胞培养进行比较，从而研究毒性的另一个重要目标。

研究方案

1。大鼠心肌细胞培养

1. 根据批准的机构动物护理和使用委员会，IACUC协议被执行的所有实验。
2. 从雄性大鼠使用前面⁴描述的方法的心（心室）（240-260克）获得大鼠心肌细胞。简单地说，用腹腔注射戊巴比妥麻醉动物（100毫克/千克;用脚趾捏法确认麻醉），然后取出心，10.0毫升，1毫米的Ca ^{2 +}含克雷布斯Ringer缓冲液，pH值7.4。
3. 漂洗心中5-6倍，除去血液，然后切换到Ca ^{2 +}的免费林格克雷布斯含有0.02％蛋白酶和0.06％胶原酶（5.0毫升/心脏）的缓冲区。孵育的心在此溶液中10-15分钟，在37℃，偶尔摇动。
4. 经过10-15分钟，洗出的酶溶液与Ca ^{2 +}的免费的Krebs Ringer缓冲额外5分钟。从弛缓性组织我们释放细胞吹打悬浮上下几次ING 25毫升吸管。
5. 通过70微米尼龙网过滤从组织分离细胞，并允许他们定居在含有0.1毫米的Ca ^{2 +}的Krebs Ringer缓冲。暂停的细胞沉淀在1.0ml含0.2毫米的Ca ^{2 +}的Krebs Ringer缓冲液。
6. 仔细层以上5.0毫升60微克/毫升牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，在15ml离心管中，向心肌细胞从nonmyocytes分开，并允许他们沉降30分钟。心肌较重，移动到管的底部。小心取出上清液细胞和介质。重复此步骤一次，以进一步纯化细胞。
7. 洗（使用0.25毫米，0.5毫米，0.75毫米和1.0毫米的Ca ^{2 +}的缓冲液的步骤）的心室肌细胞/心肌细胞，以1.0毫米的Ca ^{2 +}的缓冲液和重悬浮在由Dulbecco改良的Eagle培养基ACCT介质逐渐过渡，DMEM containi纳克2毫克/毫升牛血清白蛋白，2mM的L-肉碱，5mM的肌酸，5mM的牛磺酸，100国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。
8. 板ACCT介质的心肌细胞在100〜150 ^个 / mm ² 100毫米或35毫米层粘连蛋白的浓度包被预包被层粘连蛋白（1微克/厘米^2）的塑料培养皿或40×22毫米的玻璃盖玻片上。 1小时后，洗碗用2.0ml ACCT，除去未贴壁细胞。加入10.0毫升新鲜培养基孵育细胞。

人呼吸道上皮的基底细胞2。分化气 - 液界面（ALI）培养

1. 根据机构审查委员会促使人体气管，支气管组织从国家疾病研究交换批准的协议。细胞收获和使用已发布的程序^5,6进行文化。本程序采用细胞培养，因为他们是人类吸入风险，以信托投资一个精确的模型，但是，如果需要的话可以隔离和增长ALI月使用和/或大鼠呼吸道上皮细胞^7,8。
2. 简单地说，删除所有结缔组织和淋巴结后，使组织的小碎片（〜6.3英寸）。在乳酸林格氏液冲洗组织几次。加组织到一个50ml锥形管中，并加入蛋白酶溶液（1％Protease/0.01％DNA酶在最小必需培养基，MEM，组织，以液比（1:10））。
3. 岩石的组织在4℃过夜。通过添加10％胎牛血清的最终组织的离解。刮除上皮表面用外科手术刀并通过离心（2000 rpm离心10分钟）收集细胞。
4. 板在细胞上通过Fulcher的等 ⁹中详细描述的方法制备在特殊ALI介质胶原包被的snapwells通道之一。培养，用于通过除去根尖媒体改变到空气 - 液体界面（ALI）前5天。
5. 饲料采用ALI媒体每隔一天细胞，并允许细胞分化为另外的2-3周（进行曝光前，观察无数跳动的纤毛和黏液分泌）。用温热的PBS随着媒体的变化洗净顶面。

3，氯曝光

1. 含氯曝光系统（CES）上一个合格的化学罩内有100英尺，可提供必要的二次密封，以防止意外氯气泄漏事件的人员暴露的操作表面风速。
2. 经营体制下轻微正压（0.5英寸水柱）。干燥的空气被送入在15升/分钟和氯被馈送到达到所期望的最终的氯浓度适当的水平。该室有一个锁盖与4迷你BCU锁和低硬度硅胶垫片，以提供压力密封。
3. 通过质量流量控制器提供了₂氯混合。在CES使用含有1.0％的_C18：2在干燥的氮气压缩气体钢瓶。
4. 通过调节稀释气流定制设计的控制面板，同样调节氯离子_浓度输送至曝光室。低流量采样泵就会从室成氯分析仪排气监测的浓度，然后记录在连接到分析仪的数据采集器。
5. 在曝光之前使用流量计来保证平等送货和排气率测量中的腔室的流速。
6. 通过除去上清液介质并加入新鲜培养基（在ALI培养基底外侧培养基）制备的细胞培养物进行曝光。与代理商的任何预处理可以在这个时候进行。
7. 在两个密封的聚砜生物控制腔室暴露的气道上皮细胞的培养ALI到Cl ₂中的气体（50，100，或300 ppm的30分钟）。心肌细胞（浸没或汇合在膜上培养物）暴露于50或100ppm Cl ₂中15分钟。
8. 曝光后冲洗室与空气，直至C升₂水平低于1ppm的，可以安全地打开，取出细胞（5分钟内）。

4，跨上皮电阻（TER）测量

1. 测量气 - 液界面的TER，ALI，使用上皮voltohmmeter有一对氯化银“筷子”电极文化。
2. 平衡筷子电极在使用前，ALI媒体15分钟。
3. 添加温暖的媒体心尖（1.0毫升）和基底（2.0毫升）表面，并使用voltohmmeter的筷子电极测量TER。
4. 浸电极在心尖媒体短臂和基底介质的长臂。点击voltohmmeter的“测量”按钮来评价的电阻。
5. 该voltohmmeter具有测量欧姆或k欧姆的选项。减去电阻两端的电阻的无细胞培养支持在每个细胞层测量，得到反上皮电阻（TER）。

5，胱天蛋白酶测量

1. 加入新鲜ALI媒体（2.0毫升）的基底表面暴露后孵育的细胞在室温下。收集上清液媒体在4至24小时。
2. 通过使用商用的caspase 3/7检测试剂盒测量在媒体上清的caspase 3/7活性。

6，Western blot和免疫细胞化学

1. 用细胞裂解液如前文所述¹⁰进行Western印迹。暂停蛋白裂解液（20微克）的5倍减少上样缓冲液，煮沸5分钟。若使蛋白质裂解物进行SDS-PAGE（4-15％）和电泳印迹法所分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
2. 方框孵育膜用5％脱脂乳的洗涤缓冲液（PBS +0.1％洗涤剂）的非特异性结合，并与反SERCA2或肌节肌动蛋白一抗探测膜在1:1000稀释，过夜，在4℃下。接下来，清洗和膜孵育与各自的过氧化物酶标记的二抗和使用商业过氧化物酶检测试剂盒¹⁰之前描述的发展进行检测。
3. 对于免疫细胞化学治疗生长在插入或盖玻片的6孔​​板中以0.4％的10mM柠檬酸钠缓冲液的Triton-X-100的PBS漂洗20分钟后的活细胞。
4. 块由非特异性治疗的细胞，用5％驴血清20分钟，然后于室温孵育与非特异性IgG或个人的初级抗体特异性，以肌动蛋白或Ki-67的约束力。
5. 用PBS洗涤细胞，并用荧光标记的二抗孵育，以检测一抗和核染色剂（1μg/ ml的DAPI）。
6. 用PBS洗涤，并使用商业安装介质安装盖玻片。
7. 用荧光显微镜可视化染色。

结果

主要杆状心肌细胞上附着层粘连蛋白基质和蔓延，并分化成融合培养（ 图1A和它的插图）。这些细胞的特征还在于肌节肌动蛋白和SERCA2表达（ 图1B和1C）的基础上。大鼠心肌细胞极易受到氯气的毒性为15分钟暴露于100ppm的氯引起广泛的细胞变圆，死在水下文化和融合层破坏的生长层粘连蛋白涂层膜（ 图1D）细胞。以前也有增强细胞凋亡通过半胱天?...

讨论

当一个人呼吸有毒化学进入肺部急性毒性暴露的最常见的类型出现。这些化学物质也可以迅速吸收到血液中，并可能影响其他器官，如大脑和心脏。利用动物模型各种药剂吸入毒性进行了研究和广泛报道，但是机制了解较少。这是开发有效的治疗的一个主要障碍。 体外照射系统的缺席的背后是缺乏机械的见解的一个主要原因。在这里，我们描述了心脏肌肉和呼吸道，研究吸入有毒的化学物...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ