Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés

Résumé

Ce protocole est conçu pour démontrer Procédé d'exposition de cultures cellulaires à des produits chimiques toxiques inhalés. Exposition des différenciée interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes fournit un modèle unique de l'exposition des voies respiratoires à des gaz toxiques tels que le chlore. Dans ce manuscrit, nous décrivons effet de l'exposition au chlore sur les cultures à l'interface air-liquide de cellules épithéliales et de la culture submergée de cardiomyocytes. In vitro des systèmes d'exposition permettent études mécanistiques importantes pour évaluer les voies qui pourraient ensuite être utilisés pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.

Résumé

Les cultures cellulaires sont indispensables pour développer et d'étudier l'efficacité d'agents thérapeutiques, en vue de leur utilisation dans des modèles animaux. Nous avons la capacité unique de modéliser les cellules de l'épithélium respiratoire humain et le muscle cardiaque bien différenciées. Cela pourrait être un outil précieux pour étudier les effets délétères des produits chimiques toxiques inhalés, tels que le chlore, qui peuvent normalement interagir avec les surfaces cellulaires, et former divers sous-produits lors de la réaction avec de l'eau, et la limitation de leurs effets dans des cultures submergées. Notre modèle en utilisant des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes humaines bien différenciés à l'interface air-liqiuid contourne cette limitation ainsi que fournit l'occasion d'évaluer les mécanismes critiques de la toxicité des produits chimiques toxiques inhalés potentiels. Nous décrivons perte accrue de l'intégrité de la membrane, la caspase libération et la mort sur chimique toxique par inhalation tels que l'exposition au chlore. Dans cet article, nous proposons des méthodes pour modéliser l'exposition au chlore dans le cœur des mammifères et des voies respiratoires épithéliales caunes de la culture et des tests simples pour évaluer son effet sur ces types cellulaires.

Introduction

L'exposition à des produits chimiques toxiques inhalés (CIT) / gaz comme le chlore (Cl ₂₎ demeure un problème de santé en cours dans les expositions accidentelles ainsi que dans leur utilisation potentielle comme un agent de menace chimique. Bien que les poumons sont la cible principale, les organes tels que le coeur et le cerveau sont également touchés ^1-3. Modèles in vivo sont généralement utilisés pour les tests de toxicité de TIC, mais des essais in vitro pour l'évaluation de la toxicité est plus simple, plus rapide et plus rentable. En modèles in vitro permettent également une enquête approfondie des interactions agent de cellules qui peuvent être difficiles à évaluer in vivo. Ces systèmes in vitro dans l'exposition sont rares et, en outre, dans certains modèles classiques où les agents toxiques sont ajoutées au milieu de culture dans lequel les cellules sont immergées, les propriétés des agents peuvent changer en raison des interactions et liaison aux composants dans le milieu. Dans de tels scénarios cellulaires des systèmes de culture tels que l'interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules primaires épithéliales des voies respiratoires humaines, proposés ici, qui peuvent être directement exposés à des agents gazeux pourrait être prometteur.

Les cellules épithéliales qui tapissent les voies respiratoires sont les premières lignes de défense contre les produits chimiques toxiques inhalés. L'épithélium des voies respiratoires humaine constitue une barrière physique entre la lumière et les cellules sous-jacentes dans le poumon et participe à la réaction du poumon. Il produit un certain nombre de cytokines et d'autres agents pro-et anti-inflammatoires ainsi que sécrète le liquide de surface mucus / des voies respiratoires (ASL) recouvrant l'épithélium. Une des limitations à immergé conventionnelle dans les systèmes de culture in vitro est également que l'ASL et de mucus qui couvre la surface épithéliale est enlevé ou dilués. Cela ne reflète pas l'état physiologique des cellules épithéliales pulmonaires qui sont exposés à l'air. Ainsi, un idéal dans le système in vitro pour les tests de toxicité TIC devrait reproduire cette architecture. Il ya un grand intérêt dans le développement rapide de dépistage méthodes qui prédisent la toxicité in vivo. Les cellules épithéliales cultivées à l'ALI différencier et avoir des structures et des fonctions bien différenciées par rapport aux cellules cultivées submergés et servir un modèle supérieur des voies respiratoires.

Dans cette étude, nous décrivons l'utilisation de l'air liquide interface culture de voies respiratoires humaines (trachéo-bronchique) des cellules épithéliales pour tester toxique par inhalation de gaz toxiques et de le comparer avec une culture cellulaire immergé de cardiomyocytes, donc étudier une autre cible importante de la toxicité.

Protocole

1. Cultures Rat cardiomyocytes

1. Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel, IACUC.
2. Obtenir des cardiomyocytes de rats du cœur (ventricules) de rats mâles (240-260 g) en utilisant des méthodes décrites précédemment ^4. En bref, anesthésier les animaux en utilisant une injection intrapéritonéale de pentobarbital (100 mg / kg; confirmer l'anesthésie par la méthode de pincement de l'orteil), puis retirez le cœur en 10,0 ml, 1 mM de Ca ^{2 +} contenant un tampon Krebs Ringer, pH 7,4.
3. Rincer les coeurs 5-6x pour enlever le sang et ensuite passer à un ⁺ tampon Krebs Ringer Ca ² gratuit contenant 0,02% et 0,06% protéase collagénase A (5,0 ml / coeur). Incuber les coeurs dans cette solution pendant 10 à 15 min à 37 ° C avec agitation occasionnelle.
4. Après 10-15 minutes, laver la solution enzymatique avec un tampon de Ca ^{2 +} libre Krebs Ringer à 5 min de plus. Libérer les cellules du tissu mou nousment une pipette de 25 ml à la pipette la suspension de haut en bas plusieurs fois.
5. Séparer les cellules du tissu par filtration à travers une maille de nylon de 70 um et leur permettre de s'installer dans Ringer Krebs contenant 0,1 mM de Ca ^{2 +.} Suspendre le culot cellulaire dans 1,0 ml de tampon Krebs Ringer contenant 0,2 mM de Ca ^{2 +.}
6. Superposer soigneusement sur 5,0 ml de 60 pg / ml d'albumine de sérum bovin, BSA, 15 ml dans des tubes de centrifugation, afin de séparer les cardiomyocytes à partir de nonmyocytes et leur permettre de se déposer pendant 30 minutes. Les cardiomyocytes sont plus lourdes et se déplacent vers le fond du tube. Retirez soigneusement les cellules surnageant et les médias. Répétez cette étape une fois pour purifier les cellules.
7. Une transition graduelle de lavage (dans les étapes à l'aide de 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, et mM de Ca 1,0 ² tampon ⁺ contenant) les myocytes ventriculaires / cardiomyocytes pour mM de Ca ^{2 +} contenant du tampon 1,0 et remises en suspension dans du milieu ACCT constitué de milieu Eagle modifié par Dulbecco , DMEM containing de 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitine, la créatine 5 mM, 5 mM de taurine, 100 UI / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
8. Plaquer les cardiomyocytes dans un milieu ACCT à une densité de 100 à 150 cellules / mm ² sur 100 mm ou 35 mm revêtues de laminine des boîtes de culture en plastique ou des lamelles couvre-objet 40 x 22 mm de verre pré-enduites avec de la laminine (1 mg / cm ^2). Après 1 heure, laver la vaisselle avec 2,0 ml ACCT pour éliminer les cellules qui ne sont pas attachés. Ajouter 10,0 ml de milieu frais et incuber les cellules.

2. Interface air-liquide différencié (ALI) culture de cellules humaines Airway basales

1. Obtention de tissus humains trachéo-bronchique de recherche sur les maladies d'échange national en vertu de l'Institutional Review Board protocoles approuvés. récolte cellulaire et effectuer la culture en utilisant une procédure ^{de 5,6} publié. Cette procédure utilise des cultures de cellules car ils sont un modèle précis pour l'exposition par inhalation humaine à TIC, cependant, si nécessaire, on peut isoler et cultiver à ALI moutiliser et / ou de cellules épithéliales des voies aériennes chez le rat ^7,8.
2. En bref, faire de petits morceaux (~ ¼ pouce) du tissu après avoir retiré tous les noeuds lymphatiques et des tissus conjonctifs. Laver le tissu plusieurs fois dans une solution de Ringer lactate. Ajouter tissus dans un tube conique de 50 ml et ajouter une solution de protease (1% Protease/0.01% de la DNase dans un milieu minimal essentiel, MEM, tissu de rapport de fluide (01:10)).
3. Agitez le tissu à 4 ° C pendant une nuit. Mettre fin à la dissociation du tissu par l'addition de sérum bovin fœtal à 10%. Racler la surface de l'épithélium avec un scalpel chirurgical et recueillir les cellules par centrifugation (2000 rpm pendant 10 min).
4. Cellules de la plaque au passage un sur snapwells revêtus de collagène dans un milieu spécial ALI préparés comme décrit en détail par Foucher et al ^9. 5 jours de culture avant de changer d'interface air-liquide (ALI) en supprimant les médias apical.
5. Alimenter les cellules en utilisant les médias ALI tous les deux jours et permettent aux cellules de se différencier pour 2-3 semaines supplémentaires (observer de nombreux cils battant et la sécrétion de mucus) avant d'effectuer l'exposition. Laver la surface apicale avec du PBS chaud ainsi que des changements dans les médias.

3. Chlore exposition

1. Contenir le système d'exposition au chlore (CES) dans une hotte chimique qualifié avec une vitesse nominale de fonctionnement de 100 pieds par minute qui fournit l'enceinte de confinement secondaire nécessaire pour éviter l'exposition du personnel en cas de fuites accidentelles de chlore.
2. Faire fonctionner le système sous une légère pression positive (0,5 pouces d'eau). L'air sec est amené à 15 L / min et à un niveau approprié de chlore est introduit pour atteindre la concentration désirée en chlore final. Les chambres disposent d'un couvercle de verrouillage avec 4 mini serrures de BCU et une dureté joint en silicone bas pour assurer l'étanchéité de pression.
3. Fournir un mélange Cl ₂ par un contrôleur de débit massique. La CES utilise une bouteille de gaz comprimé contenant 1,0% de Cl ₂ dans de l'azote sec.
4. Réguler le débit d'air de dilution à l'aide duconçu sur mesure panneau de commande et de réglementer de façon similaire la concentration Cl ₂ livré aux chambres d'exposition. Une pompe d'échantillonnage de faible volume extrait de l'échappement à partir des chambres dans un analyseur de chlore pour surveiller les concentrations qui sont ensuite enregistrées sur un enregistreur de données connecté à l'analyseur.
5. Mesurer les vitesses d'écoulement à l'intérieur des chambres, avant l'exposition à l'aide d'un débitmètre pour assurer les frais de port et d'échappement égales.
6. Préparer les cultures de cellules d'exposition en enlevant les médias surnageant et ajouter du milieu frais (médias basolatérales dans les cultures ALI). Prétraitements éventuels avec les agents pourraient être effectuées à cette époque.
7. Exposer les cultures ALI cellules épithéliales des voies aériennes à Cl ₂ gaz (50, 100 ou 300 ppm pendant 30 min) dans les deux chambres étanches polysulfone de confinement biologique. Les cardiomyocytes (cultures submergées ou sur les membranes confluentes) sont exposées à 50 ou 100 ppm de Cl ₂ pendant 15 min.
8. Après l'exposition vider les chambres à air jusqu'à ce que le Cl ₂ niveau tombe en dessous de 1 ppm, et peut être ouverte en toute sécurité pour éliminer les cellules (à moins de 5 min).

4. Transepitheliale résistance électrique (TER) Mesure

1. Mesurer le TER de l'air liquide interface, ALI, cultures en utilisant une voltohmmeter épithéliale avec une paire de chlorure électrodes "baguettes" argent.
2. Equilibrer l'électrode de baguettes dans le ALI médias 15 min avant utilisation.
3. Ajouter un média chaud au apicale (1,0 ml) et basolatéral (2,0 ml) et mesurer la surface TER en utilisant les électrodes de baguettes de la voltohmmeter.
4. Trempez le bras le plus court de l'électrode dans les médias apical et le bras le plus long dans les médias basolatérales. Cliquez sur le bouton «mesure» sur la voltohmmeter pour évaluer la résistance électrique.
5. Le voltohmmeter a la possibilité de mesurer ohms ou k ohms. Soustraire la résistance à travers un support de culture acellulaire à partir de la résistance mesurée aux bornes de chaque couche de cellules pour donner le transrésistance épithéliale (TER).

5. Caspase Mesure

1. Ajouter des milieux frais ALI (2,0 ml) à la post-exposition de la surface basolatérale et incuber la cellule à la température ambiante. Recueillir milieu surnageant à 4 et 24 heures.
2. Mesurer la caspase 3/7 activité dans les surnageants de média en utilisant une caspase commercial 3/7 de la trousse de dosage.

6. Western Blot et Immunocytochemistry

1. Effectuer des transferts Western utilisant des lysats cellulaires comme décrit précédemment ^10. Suspendre le lysat de protéines (20 pg) dans 5x tampon réduite de l'échantillon et faire bouillir pendant 5 min. Soumettre le lysat de protéine à une SDS-PAGE (4-15%) et de transférer les protéines séparées sur une membrane de nitrocellulose par transfert électrophorétique.
2. Bloquer la liaison non spécifique par incubation de la membrane avec 5% de lait dans du tampon de lavage (PBS + 0,1% de détergent) et de la sonde les membranes avec des anticorps primaires contre l'actine ou SERCA2 sarcomère à 1:1000 dilution, pendant une nuit à 4 ° C. Ensuite, laver et incuber les membranes avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et de développer respectifs pour la détection comme décrit ci-dessus ¹⁰ en utilisant le kit de détection de la peroxydase du commerce.
3. Par immunocytochimie traitent des cellules vivantes cultivées sur des inserts ou des lamelles couvre-objet en verre dans des plaques de 6 puits avec 0,4% de Triton-X-100 dans du tampon de citrate de sodium à 10 mM pendant 20 min après le rinçage avec du PBS.
4. Bloquer la liaison non spécifique en traitant les cellules avec du sérum d'âne à 5% pendant 20 min, et ensuite incuber les cellules avec de l'IgG non spécifique ou spécifique des anticorps primaires individuels à l'actine sarcomère ou Ki-67.
5. Laver les cellules avec du PBS et incubation avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents pour détecter l'anticorps primaire et un colorant nucléaire (1 ug / ml de DAPI).
6. Laver avec du PBS et monter des lamelles en utilisant un milieu de montage commerciales.
7. Visualisez la coloration en utilisant un microscope à fluorescence.

Résultats

Tige principale cardiomyocytes forme attachent sur ​​des matrices de laminine et se propagent et se différencient en cultures confluentes (figure 1A et son encart). Ces cellules ont été en outre caractérisés sur la base de l'actine et de l'expression de sarcomère SERCA2 (Figures 1B et 1C). cardiomyocytes de rat sont très sensibles à la toxicité du chlore en tant que 15 minutes d'exposition à 100 ppm de chlore a causé des arrondissement des cel...

Discussion

Le type le plus commun des expositions toxiques aigus se produit lorsque l'on respire un produit chimique toxique dans les poumons. Ces produits chimiques peuvent aussi être prises rapidement dans la circulation sanguine et peuvent avoir un impact d'autres organes tels que le cerveau et le cœur. Toxicité à l'inhalation de divers agents utilisant des modèles animaux sont étudiés et largement rapporté, mais les mécanismes sont moins bien compris. Il s'agit d'un obstacle majeur dans le dévelop...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ