Zehirli İnhale Kimyasal Test in vitro Hücre Kültürü Modeli

Özet

Bu protokol, inhale zehirli kimyasal maddelere maruz kalma, hücre kültürlerinin bir yöntem göstermek için tasarlanmıştır. Farklı hava-sıvı arayüzü hava yolu epitel hücreleri (ALI) kültürler maruz kalmak, klor gibi zehirli gazlar hava yolu maruz eşsiz bir model sağlar. Bu yazıda; klor epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüz kültürleri üzerinde maruz kalma ve kardiyomiyositlerde daldınlarak kültür etkisini tarif eder. In vitro maruz sistemleri önemli mekanik çalışmalar, daha sonra yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi için yararlanılabilir yollarını belirlemek için izin verir.

Özet

Hücre kültürleri önce hayvan modellerinde kullanımı için terapötik maddeler, etkinliğini geliştirmek ve çalışma için vazgeçilmezdir. Biz de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel ve kalp kası hücrelerini modellemek için benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Bu, normal olarak hücre yüzeyleri ile etkileşim ve su ile reaksiyona sokulması, ve daldırılmış kültürde etkilerini sınırlayarak üzerine çeşitli yan ürünler oluşturabilir, örneğin klor gibi toksik kimyasallar inhale, zararlı etkilerini incelemek için değerli bir araç olabilir. Hava-liqiuid arayüzü de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel hücre kültürleri kullanarak Bizim modelimiz bu sınırlama circumvents yanı sıra potansiyel zehirli solunan kimyasalların toksisite kritik mekanizmalarını değerlendirmek için bir fırsat sağlar. Biz membran bütünlüğünün kaybı gelişmiş, örneğin klor maruz kalma gibi toksik solunan kimyasal, kaspaz salınımı ve ölümü tarif. Bu yazıda, memeli kalp ve solunum yolu epitel c klor pozlama modellemek için yöntemler önermekkültür ve bu hücre tipleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için basit testler arşın.

Giriş

Toksik inhale kimyasal (TIC) maruz / klorin (Cl ₂₎ gibi gazlar kazara maruz kalma, hem de kimyasal bir tehdit madde olarak potansiyel kullanımı devam eden bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Akciğerler birincil hedef olmasına rağmen, bu tür, kalp ve beyin gibi organlar da in vivo modeller genellikle tikler ikinci test toksisite için kullanılır. ^1-3 etkilenmez, ancak toksisite değerlendirmesi için in vitro deneylerde maliyet etkin, daha basit, daha hızlı ve daha vardır. In in vitro modeller de in vivo değerlendirmek için zor olabilir aracı-hücre etkileşimlerinin kapsamlı araştırma için izin verir. Bu tür in vitro maruz sistemleri nadirdir ve bundan başka, toksik maddeler, hücrelerin batık edildiği kültür ortamına ilave bazı geleneksel modeller ile, maddelerin özellikleri nedeniyle etkileşimleri ve ortam içinde bileşenlerine bağlanma değiştirebilir. Gibi bu tür senaryolar hücre kültür sistemlerinde hava-sıvı arayüzü (ALI, Gazlı maddeler maruz olabilir burada önerilen birincil insan solunum yolu epitel hücreleri, of) kültürleri umut verici olabilir.

Hava yolunu döşeyen epitel hücreleri solunan toksik kimyasallara karşı ilk savunma hatları. Insan solunum yolu epitel akciğerde lümen ve temel hücreler arasında, fiziksel bir bariyer oluşturur ve akciğerin yanıt olarak katılır. Bu sitokinler ve diğer pro-ve anti-enflamatuar maddelerin sayısı hem de epitel mukus kaplama / hava yolu yüzey sıvısı (ASL) salgılar üretir. In vitro kültür sistemleri batık geleneksel olarak sınırlamalar biri epitel yüzeyini kaplayan ASL ve mukus kaldırıldı veya seyreltilmiş olması aynı zamanda. Bu havaya maruz kalan akciğer epitel hücrelerin fizyolojik durumunu yansıtmaz. Böylece, EFT toksisite testleri için vitro sistemde ideal Bu mimariye çoğaltmak gerekir. Hızlı tarama m yönelik büyük ilgi varvivo toksisitesi tahmin ethods. ALI yetiştirilen epitel hücreleri ayırt var ve iyi farklılaşmış yapıları ve işlevleri batık yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında ve hava yollarının üstün bir model işlevi.

Bu çalışmada, insan solunum yolu hava-sıvı arayüzü kültür zehirli Solunum toksisite için test (trakeo) epitel hücreleri kullanılmasını tarif eder ve bu nedenle toksiklik önemli bir hedef eğitim, kardiyomiyosit bir batık hücre kültürü ile karşılaştırın.

Protokol

1.. Rat kardiyomiyosit Kültürler

1. Tüm deneyler kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, IACUC tarafından onaylanan protokoller altında yapıldı.
2. Daha önce tarif edilen yöntemler kullanılarak ⁴ erkek sıçan kalplerinde (ventriküller) (240-260 g), sıçan kardiyomiyositlerde elde edilir. (100 mg / kg; ayak tutam yöntem ile anestezi teyit) Kısaca, pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlara anestezi ve daha sonra 10.0 ml, Krebs Ringer tamponu, pH 7.4 ihtiva eden 1 mM ^{Ca2 +} içine kalpleri çıkarın.
3. Kan kaldırmak ve daha sonra% 0.02 proteaz ve% 0.06 kollajenaz A (5.0 ml / kalp) içeren bir Ca ^{2 +} ücretsiz Krebs Ringer tamponu geçmek için kalplerini 5-6x durulayın. Ara sıra çalkalanmak suretiyle, 37 ° C'de 10-15 dakika boyunca bu çözelti içinde kalpleri inkübe edin.
4. 10-15 dakika sonra, ilave bir 5 dakika boyunca Ca ^{2 +} Krebs Ringer tamponu ile enzimatik çözüm yıkayın. Sarkık doku bize gelen hücreleri bırakınyukarı ve aşağı birkaç kez süspansiyon pipetleme 25 ml pipet ing.
5. 70 mikron naylon elek içinden süzme ile doku hücreleri ayırın ve bunları 0.1 mM ^{Ca2 +} içeren Krebs Ringer tamponu içinde yerleşmeye izin verir. 0.2 mM ^{Ca2 + 'yı} içeren 1.0 ml Krebs Ringer tamponu içerisinde hücre pelletini askıya alınması.
6. Dikkatlice nonmyocytes ikinci kardiyomiyositlerde ayrı ve bunları 30 dakika boyunca yerleşmek için izin vermek için 15 ml santrifüj tüplerine üzerine 5.0 ml 60 ug / ml bovin serum albümini, BSA, tabaka. Kardiyomiyositlerde ağırdır ve tüpün altına hareket eder. Süpernatan dikkatlice hücreler ve ortam çıkarın. Ayrıca hücreleri arındırmak için bir kez bu adımı tekrarlayın.
7. Yavaş yavaş ventriküler myocytes / kardiyomiyositlerde 1.0 mM ^{Ca2 +} içeren tampon (0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM ve 1.0 mM ^{Ca2 +} içeren tampon kullanılarak adımlarla) yıkanması ve Dulbecco Modified Eagle Medium oluşan ACCT ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ile geçiş , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-karnitin, 5 mM kreatin, 5 mM taurin, 100 IU / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin.
8. 100 mm ya da 35 mm laminin üzerinde 100-150 hücre / mm ² 'lik bir yoğunlukta ACCT ortam içinde kardiyomiyositlerde Plaka laminin (1 ug / cm ²⁾ ile önceden kaplanmış plastik kültür kaplarına ya da 40 x 22 mm cam lamelleri ile kaplı olacaktır. 1 saat sonra, bağlı olmayan hücreleri çıkarmak için 2.0 ml ACCT ile bulaşıkları yıkama. Taze ortam içinde 10.0 ml ilave edilir ve hücreleri inkübe edin.

İnsan Havayolu Epitelyal Bazal Hücre 2. Farklılaştırılmış hava-sıvı arayüzü (ALI) Kültür

1. Kurumsal Değerlendirme Kurulu bünyesinde Ulusal Hastalık Araştırma Kavşağı insan trakeabronşial dokuları ittihaz protokolleri onayladı. Hücre hasat ve yayınlanan bir prosedür ^5,6 kullanarak kültürünü gerçekleştirmek. Gerekirse onlar tikler insan soluma için kesin bir örnek olarak bu işlemi cep kültürleri kullanır, ancak, bir izole ve ALI mo büyüyebilirve / veya sıçan solunum yolu epitel hücreleri ^7,8 kullanın.
2. Kısaca, bütün bağ dokusu ve lenf düğümleri çıkardıktan sonra küçük doku parçaları (~ ¼ inç) yapmak. Ringer çözeltisi içinde dokuya birkaç kez yıkayın. 50 ml konik tüp doku ekleme ve (minimum temel ortam, MEM, sıvı oranında (1:10) bir doku içinde% 1 Protease/0.01% DNase) proteaz çözeltisi ekleyin.
3. Gece boyunca 4 ° C'de doku sallayın. ,% 10 fetal inek serumu ilave ederek doku ayrışma sona erdirir. Cerrahi bir neşter ile epitel yüzey kazıyın ve santrifüj (10 dakika boyunca 2000 rpm) ile hücreleri toplamak.
4. Fulcher ve ark ⁹ ile detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi hazırlanmıştır özel ALI ortam içinde kollajen kaplı snapwells üzerine aktarılarak bir Levha hücreleri. Apikal medya kaldırarak hava-sıvı arayüzü (ALI) değiştirmeden önce 5 gün boyunca kültür.
5. Her günaşırı ALI medyayı kullanarak hücreleri beslemek ve hücreler ilave 2-3 hafta için (ayırt etmek için izinmaruz gerçekleştirmeden önce çok sayıda dayak kirpikler ve mukus salgılanmasını) gözlemlemek. Ortam değişiklikleri ile birlikte sıcak PBS ile apikal yüzey yıkayın.

3.. Klor Pozlama

1. Kazara klor kaçağı durumunda personelin maruz kalmasını önlemek için gerekli ikincil çevreleme sağlayan 100 fpm operasyonel bir yüzü hızı ile nitelikli bir kimyasal kaput içinde klor pozlama sistemi (CES) içerirler.
2. Hafif bir pozitif basıncı su (0.5 inç) altında sistemi çalıştırın. Kuru hava 15 L / dakika ve klor istenen son klor konsantrasyonunu elde etmek için beslenen uygun bir seviyede verilir. Hazneler 4 mini BCU kilitler ve basınç sızdırmazlık sağlamak için düşük bir durometre silikon conta ile bir kilitleme kapağı vardır.
3. Bir Kütle Akış Kontrolörü ile Cl ₂ karışımı sunun. CES kuru azot Cl _2% 1,0 ihtiva eden bir basınçlı gaz silindiri kullanır.
4. Ile seyreltme hava akışını düzenlerözel kontrol paneli tasarlanmış ve benzer poz odalarına teslim Cl ₂ konsantrasyonunu düzenler. Düşük hacimli bir örnekleme pompası ardından analizörü bağlı bir veri kayıt cihazı üzerinde kaydedilir konsantrasyonlarını izlemek için bir klor analizörü içine odalarından egzoz çeker.
5. Maruz kalmadan önce eşit dağıtım ve egzoz oranlarını sağlamak için bir akış ölçer kullanılarak odaları içindeki akış hızları ölçer.
6. Süpernatan ortamı kaldırılması ve taze ortam (ALI kültürlerde bazolateral media) eklenmesi ile etkileşimi için hücre kültürlerinin hazırlanması. Ajanlar ile herhangi önişlemlerinde bu zamanda yapılabilir.
7. İki sızdırmaz polisülfon biyolojik tecrit odalarına Cl ₂ gazının (50, 100 ya da 30 dakika boyunca 300 ppm) kadar hava yolu epitel hücrelerinin kültürleri ALI Açığa. Kardiyomiyositlerde (batık veya zarda kültürleri ortak akışlı) 15 dakika için 50 veya 100 ppm Cl ₂ maruz kalmaktadır.
8. Maruz kaldıktan sonra ° C'ye kadar hava odacıkları yıkayınl ₂ seviyesi 1 ppm altına ve güvenli bir şekilde (5 dakika içinde) hücreleri çıkarmak için açılabilir.

4. Transepitelyal Elektrik Direnci (TER) Ölçüm

1. Hava-sıvı-arayüzü TER ölçün, ALI, gümüş klorür "çubuk" elektrot çifti ile bir epitel voltohmmeter kullanarak kültürler.
2. Kullanmadan önce ALI ortam 15 dakika içinde, çubuk elektrot dengelenmesi.
3. Yüzey (2.0 mi) (1.0 mi) apikal ve bazolateral sıcak ortam ekleyin ve voltohmmeter ve çubuk elektrotları kullanarak TER ölçer.
4. Apikal medyadaki elektrot kısa kol ve bazolateral medyada uzun kolu batırın. Elektrik direncini değerlendirmek için voltohmmeter üzerindeki 'tedbir' düğmesine tıklayın.
5. Voltohmmeter ohm veya k ohm seçeneği vardır. Trans elde etmek için her bir hücre tabakası boyunca ölçülen direnci bir hücresiz kültür destek karşısında direnci çıkarmaepitel direnci (TER).

5.. Kaspaz Ölçme

1. Basolateral yüzey sonrası maruz taze ALI medya (2.0 ml) ekleyin ve oda sıcaklığında hücreyi kuluçkaya yatmaktadır. 4 ve 24 saat sonra süpernatan ortamı toplayın.
2. Ticari bir kaspaz 3/7 deney kiti kullanılarak ortam yüzer kaspaz 3/7 aktivitesi ölçün.

6.. Western Blot ve İmmünositokimya

1. Daha önce tarif edildiği ^{gibi, 10,} hücre lizatları kullanılarak western blot yapın. 5x örnek tampon maddesi içinde indirgenmiş lizat proteini (20 ug) askıya alma ve 5 dakika kaynatılır. SDS-PAGE (% 4-15) için, protein lizat Konu ve elektroforetik blotting ile bir nitroselüloz membrana ayrılan proteinler aktarın.
2. Yıkama tamponu içinde% 5 süt (PBS +% 0.1 deterjan) ile membran inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma bloke edin ve gece boyunca 4 ° C 'de, 1:1000 seyreltmede SERCA2 veya sarkomerik aktine karşı primer antikorlar ile zarlarının ölçülmesi. Daha sonra, yıkama ve inkübe membranlar ilgili peroksidaz-konjuge sekonder antikor ve peroksidaz algılaması ticari bir kit ^{kullanılarak, 10} daha önce anlatıldığı gibi tespiti için geliştirmek.
3. Immunositokimya için PBS ile durulandıktan sonra 20 dakika boyunca 10 mM sodyum sitrat tampon maddesi içinde% 0.4 Triton-X-100 ile 6 oyuklu plakalar içinde uçlar ya da cam lameller üzerinde büyümüş canlı hücreleri tedavi.
4. Block spesifik olmayan 20 dakika boyunca% 5 eşek serumu ile hücrelerin işlenmesi ve daha sonra sarkomerik aktin ya da Ki-67 spesifik olmayan spesifik IgG veya bireysel primer antikorlar ile inkübe hücreleri ile bağlama.
5. Hücrelerin PBS ile yıkayın ve birincil antikor ve bir nükleer boya (1 ug / ml DAPI) tespit etmek için floresan-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
6. PBS ile yıkayın ve ticari montaj medyayı kullanarak lamelleri montaj.
7. Bir floresan mikroskop kullanılarak lekelenme gözünüzde canlandırın.

Sonuçlar

İlköğretim çubuk şekilli kardiyomiyositler laminin matrisler üzerine takmak ve (Şekil 1A ve inset) yaymak ve birleşen kültürlerin içine ayırt. Bu hücreler, bundan başka sarkomerik aktin ve SERCA2 ekspresyonu (Şekil 1B ve 1C) olarak karakterize edilmiştir. Sıçan kardiyomiyositler laminin kaplı membranların (Şekil 1D) üzerinde yetiştirilen hücreler üzerinde batık kültürler ve birleşen tabakalarının bozulmasına geniş hücre...

Tartışmalar

Bir ciğerlerine zehirli bir kimyasal nefes zaman akut toksik risklerin en yaygın türü oluşur. Bu kimyasallar da hızlı bir şekilde kan alınmış olabilir ve bu, beyin ve kalp gibi diğer organları etkileyebilir. Hayvan modelleri kullanarak çeşitli maddelerin solunması toksisitesi okudu ve yaygın bildirilen, ancak mekanizmaları daha az anlaşılmıştır. Bu etkili tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir engeldir. In vitro maruziyet sistemlerinin bulunmaması mekanistik anlayış eksikliği arka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ