В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования

Резюме

Этот протокол предназначен для демонстрации метода экспозиции клеточных культур в ингаляционных токсичных химических веществ. Выдержка из дифференцированной воздуха и жидкой фаз (ALI) культур эпителиальных клеток дыхательных путей предоставляет уникальную модель воздействия дыхательных путей токсичных газов, таких как хлор. В этой рукописи мы опишем эффект воздействия хлора на воздух-жидкость культур эпителиальных клеток и глубинной культуре кардиомиоцитов. В пробирке системы воздействия позволяют важные механистические исследования для оценки пути, которые могли бы быть использованы для разработки новых терапевтических агентов.

Аннотация

Клеточные культуры необходимы для развития и изучения эффективности терапевтических агентов, до их использования в животных моделях. У нас есть уникальная возможность моделировать хорошо дифференцированных человеческих эпителия дыхательных путей и клетки мышцы сердца. Это может быть бесценным инструментом для изучения вредных эффектов токсичных ингаляционных химических веществ, таких как хлор, которые могут нормально взаимодействовать с поверхности клеток, и образуют различные побочные продукты при взаимодействии с водой, а также ограничение их последствий в затопленных культур. Наша модель, используя хорошо дифференцированных культур человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток на радиоинтерфейса-liqiuid обходит это ограничение, а также предоставляет возможность оценить критические механизмы токсичности потенциальных ядовитых ингаляционных химических веществ. Мы описываем повышенную потерю целостности мембраны, каспазы-релиз и смерть токсичных вдыхаемого химических например воздействия хлора. В этой статье мы предлагаем методы для моделирования воздействия хлора в сердце млекопитающих и дыхательных путей эпителиальных слоктей в культуре и простых тестов, чтобы оценить его влияние на этих типов клеток.

Введение

Воздействие токсичных химических веществ, вдыхаемых (тики) / газы, такие как хлор (Cl ₂₎ остается постоянной проблемой здравоохранения в случайных воздействий, а также в их потенциальное использование в качестве химического агента угрозы. Хотя легкие являются первичной мишенью, органы, такие как сердце и мозг, также страдают ^1-3. IN VIVO модели, как правило, используется для тестирования токсичности от ТЭП, но в пробирке тесты для оценки токсичности проще, быстрее и более экономически эффективным. В модели пробирке также предусмотреть возможность широкого исследования агент-клеточных взаимодействий, которые могут быть трудно оценить в естественных условиях. Такие пробирке системы, связанный с воздействием редки и, более того, в некоторых обычных моделей, где токсичные вещества добавляются к культуральной среде, в которой клетки погруженной, свойства агентов могут изменяться в связи с взаимодействиями и связывание с компонентами в среде. В таких случаях клеточных систем культуры, таких как воздух-жидкость (ALI) культур первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей, предлагаемых здесь, которые могут быть непосредственно подвергающихся газообразных агентов может быть перспективным.

Эпителиальные клетки, выстилающие дыхательные пути являются первыми линии обороны против ингаляционных токсичных химических веществ. Человеческий эпителий дыхательных путей образует физический барьер между просветом и нижележащих клеток в легких и участвует в реакции легких. Она производит ряд цитокинов и других про-и противовоспалительных средств, а также выделяет поверхностную слизь / дыхательных путей жидкостью (ASL), покрывающую эпителий. Одним из ограничений в обычных погружен в культурах клеток также, что ASL и слизи, которые покрывают поверхности эпителиальных удалена или разбавленный. Это не отражает физиологическое состояние легких эпителиальных клеток, которые подвергаются воздействию воздуха. Таким образом, идеал в системе экстракорпорального для испытаний на токсичность TIC должны повторить эту архитектуру. Существует большой интерес к разработке быстрого скрининга мethods которые предсказывают в естественных условиях токсичности. Эпителиальные клетки, выращенные на ALI дифференцировать и имеют хорошо дифференцированные структуры и функции по сравнению с клетками, выращенных затопленных и служить превосходной модель дыхательных путей.

В этом исследовании, мы описываем использование воздушно-жидкостным интерфейса культуры человеческого дыхательных путей (трахеобронхиального) эпителиальных клеток для тестирования ядовитый вдыхаемый газ токсичность и сравнить его с глубинной культуре клеток кардиомиоцитов, следовательно, изучая еще один важный цель токсичности.

протокол

1. Крыса кардиомиоцитов Культуры

1. Все эксперименты проводились под протоколами, утвержденными институциональной уходу и использованию животных комитета, IACUC.
2. Получить кардиомиоцитов крыс из сердец (желудочков) самцов крыс (240-260 г), используя методы, описанные ранее ^4. Вкратце, обезболить животных с помощью внутрибрюшинного введения пентобарбитала (100 мг / кг; подтвердить анестезию ног метода пинч), а затем удалить сердца в 10,0 мл, 1 мМ Ca ^{2 +,} содержащей Кребс звонка буфер, рН 7,4.
3. Промыть сердцах 5-6х для удаления крови, а затем переключиться на Ca ^{2 +} свободного буфера Кребса Рингера, содержащего 0,02% протеазы и 0,06% коллагеназы А (5,0 мл / сердце). Инкубируйте сердца в этом растворе в течение 10-15 мин при 37 ° С с периодическим встряхиванием.
4. После 10-15 мин, смыть ферментативную решение с Ca ^{2 +} свободного буфера Кребса Рингера для еще 5 мин. Отпустите клетки от вялого ткани намиING 25 мл пипетки с помощью пипетки подвески вверх и вниз несколько раз.
5. Отделите клетки от ткани путем фильтрации через нейлоновую сетку 70 мкм и позволить им поселиться в Кребса Рингера буфере, содержащем 0,1 мМ Ca ^{2 +.} Приостановить осадок клеток в 1,0 мл Кребс Ringer буфере, содержащем 0,2 мМ Ca ^{2 +.}
6. Осторожно слой над 5,0 мл 60 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина, BSA, в 15 мл центрифужные пробирки, чтобы отделить кардиомиоцитов из nonmyocytes и дать им возможность поселиться в течение 30 мин. Кардиомиоциты тяжелее и перейти к нижней части трубы. Удалить тщательно супернатант клеток и средств массовой информации. Повторите этот шаг один раз для дальнейшей очистки клеток.
7. Постепенно переход промывкой (с шагом использованием 0,25, 0.5 мм, 0,75 мм, и 1,0 мМ Ca ^{2 +,} содержащий буфер) желудочковой миоциты / кардиомиоцитов до 1,0 мм Ca ^{2 +,} содержащий буфер и ресуспендировали в ACCT среде, состоящей из Игла в модификации Дульбекко , DMEM containiнг 2 мг / мл BSA, 2 мМ L-карнитин, 5 мМ креатин, 5 мМ таурина, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
8. Plate кардиомиоцитов в ACCT среде при плотности от 100 до 150 клеток / мм ² на 100 мм или 35 мм ламинином покрытием пластмассовые чашки для культивирования или 40 х 22 мм покровные стекла, предварительно покрытых ламинином (1 мкг / см ^2). Через 1 ч мыть посуду с 2,0 мл АККТ для удаления клеток, которые не прикреплены. Добавить 10,0 мл свежей средой и инкубировать клетки.

2. Дифференцированный воздуха и жидкости интерфейс (ALI) Культура человека эпителия дыхательных путей базальных клеток

1. Закупка трахеобронхиального тканей человека от Национального заболеваний Научно-исследовательского обмена под Institutional Review Board одобрил протоколы. Урожай сотовый и выполнять культуру, используя процедуры, опубликованной ^5,6. Эта процедура использует клеточные культуры, поскольку они являются точным модель для человеческого ингаляционных воздействиях ТЭП, однако, при необходимости можно изолировать и вырастить на Али М.О.использовать и / или крыса эпителиальных клеток дыхательных путей ^7,8.
2. Вкратце, сделать небольшие кусочки (~ ¼ дюйма) на ткани после удаления всех соединительной ткани и лимфатические узлы. Вымойте ткань несколько раз в растворе Рингер-лактата. Добавить тканей к 50 мл коническую трубку и добавить протеазы решение (1% Protease/0.01% ДНКазную в минимальной необходимой информации, сувениры, ткани соотношения жидкости (1:10)).
3. Rock ткани при 4 ° С в течение ночи. Конец диссоциации ткани добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Царапать поверхность эпителиального с хирургическим скальпелем и сбора клеток путем центрифугирования (2000 оборотов в минуту в течение 10 мин).
4. Пластина клеток при прохождении один на покрытые коллагеном snapwells в специальной ALI среде, приготовленной, как описано подробно Фулчер и др. ^9. Культура в течение 5 дней до перехода на воздух и жидкой фаз (ALI), удаляя верхушечные СМИ.
5. Поток клеток с использованием ALI СМИ каждый дополнительный день и позволяют клеткам дифференцироваться в дополнительных 2-3 недели (наблюдать многочисленные избиения реснички и секрецию слизи) перед выполнением воздействия. Вымойте апикальной поверхности теплой PBS наряду с изменениями СМИ.

3. Хлор экспозиции

1. Содержат систему экспозиции хлора (ЕЭП) внутри квалифицированным химической капот с оперативной скоростью лица 100 футов в минуту, что обеспечивает необходимую вторичную защитную оболочку, чтобы предотвратить облучение персонала в случае аварийных утечек хлора.
2. Функционирование системы при небольшом избыточном давлении (0,5 дюйма воды). Сухой воздух подается в 15 л / мин и соответствующий уровень хлора подается для достижения желаемой конечной концентрации хлора. Камеры имеют фиксирующий крышку с 4 мини-BCU замков и низкой твердомера силиконовой прокладкой, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
3. Доставьте Cl ₂ смесь через регулятор массового расхода. CES использует газовый баллон сжатого, содержащего 1,0% Cl ₂ в атмосфере сухого азота.
4. Регулировать разрежающего воздуха с помощьюспециально созданных панель управления и так же регулировать концентрацию Cl ₂ доставлены в камеры облучения. Низкий объем насос отбора проб тянет выхлопных газов от камеры в анализатор хлора для мониторинга концентраций, которые затем записанные на регистратор данных, подключенный к анализатору.
5. Измерение скорости потоков в камерах перед воздействием использованием расходомера, чтобы обеспечить равные скорости доставки и выхлопных газов.
6. Подготовьте клеточных культур для воздействия удалением надосадочной СМИ и добавления свежей среды (базолатеральных СМИ в ALI культур). Любые виды предварительной обработки с агентами могут быть выполнены в это время.
7. Expose культур Али эпителиальных клеток дыхательных путей, чтобы Cl ₂ газа (50, 100 или 300 частей на миллион в течение 30 мин) в двух запечатанных полисульфоновую биоизоляции камер. Кардиомиоциты (погруженный или Конфлюэнтные культуры на мембранах) подвергаются 50 или 100 частей на миллион Cl ₂ в течение 15 мин.
8. После воздействия не промойте камеры с воздухом до Cл ₂ уровень падает ниже 1 промилле и может быть безопасно открыт для удаления клеток (в течение 5 мин).

4. Трансэпителиального электрического сопротивления (TER) Измерение

1. Измерьте TER воздушно-жидкостной-интерфейс, АЛИ, культуры, используя эпителиальный voltohmmeter с парой хлорид серебра "палочку" электродами.
2. Равновесие палочку электрод в АЛИ СМИ 15 мин перед использованием.
3. Добавить теплую СМИ, чтобы верхушечная (1,0 мл) и базолатеральная (2,0 мл) поверхность и измерьте TER с помощью палочки для еды электроды voltohmmeter.
4. Dip более короткий рычаг электрода в апикальных сред и чем дольше руку в базолатеральной массовой информации. Нажмите кнопку "мера" на voltohmmeter оценить электрическое сопротивление.
5. Voltohmmeter имеет опцию для измерения Ом или кОм. Вычтите сопротивление через поддержку культуры бесклеточной от сопротивления, измеренного на каждом клеточном слое с получением трансэпителиальных сопротивление (TER).

Каспазы измерения 5.

1. Добавить свежий ALI носитель (2,0 мл) в базолатеральной поверхности после облучения и инкубировать в клетку при комнатной температуре. Сбор супернатант СМИ на 4 и 24 часов.
2. Измерьте каспазы 3/7 деятельность в средствах массовой информации супернатантов с использованием коммерческого каспазы 3/7 набора для анализа.

6. Вестерн-блот и Иммуноцитохимия

1. Выполните вестерн-блоттинга с использованием клеточных лизатов, как описано выше ^10. Приостановить лизат белков (20 мкг) в 5-кратным сниженной буфера для образцов и кипятить в течение 5 мин. Тема белка лизата в ДСН-ПААГ (4-15%) и передать выделенные белки на нитроцеллюлозную мембрану посредством электрофореза блоттинга.
2. Блок неспецифическое связывание путем инкубации мембрану с 5% молоке в промывочном буфере (PBS + 0,1% моющего средства) и зонда мембраны с первичными антителами против SERCA2 или саркомера актина в разведении 1:1000, в течение ночи при 4 ° С. Затем промыть и выдержать в мембраны с соответствующими пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами и развивать для обнаружения, как описано выше ¹⁰ с использованием коммерческого набора обнаружения пероксидазы.
3. Для лечения иммуноцитохимии живые клетки, выращенные на вставками или покровные стекла в 6-луночные планшеты с 0,4% Triton-X-100 в 10 мМ буфере цитрата натрия в течение 20 мин после промывки PBS.
4. Блок неспецифического связывания обработкой клеток с 5% сыворотки осла в течение 20 мин, а затем инкубируют клетки с неспецифическим IgG или отдельных первичных антител, специфичных к саркомера актина или Ki-67.
5. Промывают клетки с PBS и инкубировали с флуоресцентными-конъюгированные вторичные антитела для выявления первичного антитела и окрашивающим ядра (1 мкг / мл DAPI).
6. Промыть PBS и смонтировать покровные с использованием коммерческих монтажные СМИ.
7. Визуализируйте окрашивание с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Первичная стержневых кардиомиоциты установка на ламинином матриц и распространения и дифференцироваться в сливающихся культур (рис. 1А и его вставку). Эти клетки были дополнительно характеризуется на основе саркомера актина и выражения SERCA2 (фиг. 1В и 1С). Крыс...

Обсуждение

Наиболее распространенным типом острых токсичных веществ происходит, когда один дышит ядовитый химикат в легкие. Эти химические вещества могут также быстро переносят в кровоток и может повлиять на другие органы, такие как мозг и сердце. Ингаляционная токсичность различных агентов, ис...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ