有毒吸入化学試験のためのin vitroでの細胞培養モデルにおける

要約

このプロトコルは、有毒な化学物質を吸入するための細胞培養物の露光方法を実証するために設計されている。差別化され気液界面の気道上皮細胞の（ALI）の文化の暴露は、塩素などの有毒ガスに対する気道曝露のユニークなモデルを提供します。本稿では、上皮細胞および心筋細胞の液体培養の気液界面培養物における塩素曝露の影響を記載している。 インビトロ露光システムは、重要な機構的研究は、次いで、新規な治療薬を開発するために利用することができる経路を評価することを可能にする。

要約

細胞培養物は、従来の動物モデルにおけるそれらの使用、治療薬の効力を開発し研究することが不可欠である。我々は、よく分化したヒト気道上皮および心筋細胞をモデル化する独特の能力を有する。これは、通常、細胞表面と相互作用し、水と反応し、水没の文化でその効果を制限する際に、様々な副生成物を形成することができる塩素などの有毒化学物質の吸入、の有害な影響を研究するための貴重なツールである可能性があります。エアliqiuid界面における高分化ヒト気道上皮細胞培養物を使用して我々のモデルは、この制限を回避するだけでなく、潜在的な有毒化学物質の吸入毒性の重要なメカニズムを評価する機会を提供します。私たちは、このような塩素暴露などの有毒化学物質の吸入の際に強化された膜の完全性の損失、カスパーゼリリースと死について説明します。この記事では、哺乳動物の心臓や気道上皮Cの塩素暴露をモデル化する方法が提案されている文化とこれらの細胞型への影響を評価するための簡単​​なテストでのエル。

概要

塩素などの有毒化学物質の吸入（TICを）/ガス（CL _2）への曝露は、偶発的暴露中だけでなく、化学的脅威エージェントとしての使用の可能性の継続的な健康問題のまま。肺が主なターゲットであるが、このような心臓や脳などの臓器はまた、in vivoモデルは、一般のTICからテストの毒性のために使用されています^。1-3に影響^を与えたが、毒性評価のためのin vitroアッセイで効果的なコスト、単純で、より速く、より公開されています。 でvitroモデルは、in vivoで評価することが困難な場合があるエージェント-細胞相互作用の広範な調査を可能にします。このようなインビトロ露光システムはまれであり、また、毒性因子は、細胞を浸漬した培養培地に添加されるいくつかの従来のモデルでは、薬剤の特性は、相互作用は、培地中の成分への結合を変更することができる。例えば、このようなシナリオの細胞培養系における気液界面（ALI）を直接ガス状物質にさらされる可能性がここで提案初代ヒト気道上皮細胞の培養物は有望であり得る。

気道の内側を覆う上皮細胞は、吸入毒性化学物質に対する防御の最初の行です。ヒト気道上皮は、肺内腔と基礎となる細胞との間の物理的な障壁を形成し、肺の応答に参加しています。これは、サイトカインおよび他のプロと抗炎症剤の数を生成だけでなく、粘液/上皮をカバーする、気道表面液（ASL）を分泌する。 インビトロ培養系に沈め従来における制限の1つは、上皮表面を覆うASL粘液を除去または希釈されることもある。これは、空気にさらされている肺上皮細胞の生理状態を反映していない。このように、TIC毒性試験のためのin vitro系における理想は、このアーキテクチャを複製する必要があります。迅速なスクリーニングmを開発することに大きな関心が寄せられている生体毒性を予測するethods。 ALIで増殖させた上皮細胞が水没し、気道の優れたモデルを提供し増殖した細胞と比較して、高分化型の構造と機能を差別化している。

本研究では、有毒吸入ガスの毒性をテストするためのヒト気道（気管支）上皮細胞の気液界面の文化の使用を記載し、したがって毒性のもう一つの重要な目標を検討し、心筋細胞の水没細胞培養と比較します。

プロトコル

1。ラット心筋細胞培養

1. 全ての実験は、施設内動物のケアと使用委員会、動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下で実施された。
2. 以前に⁴記載の方法を使用してオスのラットの心臓（心室）（240〜260グラム）から、ラットの心筋細胞を得る。 （100 mg / kgで、つま先のピンチ方式による麻酔を確認する）簡単に言えば、ペントバルビタールの腹腔内注射を使用して動物を麻酔した後、10.0ミリリットル、クレブスリンガー緩衝液（pH7.4）を含む1のCa ^{2 +}に心を取り除く。
3. 血液を除去した後、0.02％プロテアーゼおよび0.06％コラゲナーゼA（5.0ミリリットル/ハート）を含むCa ^{2 +を}無料でクレブスリンガーバッファに切り替えることが心の5-6Xを洗浄します。時々振盪しながら37℃で10〜15分間この溶液に心をインキュベートする。
4. 10〜15分後、さらに5分間のCa ^{2 +}を含まないクレブスリンガー緩衝液で酵素液を洗い流す。弛緩性組織私たちから細胞を放出サスペンション上下に数回ピペッティングして25ミリリットルピペットをING。
5. 70μmのナイロンメッシュを通して濾過することにより、組織から細胞を分離し、それらを0.1のCa ^{2 +を}含むクレブスリンガー緩衝に定住することができます。 0.2のCa ^{2 +を}含む1.0ミリリットルクレブスリンガー緩衝液中の細胞ペレットを一時停止します。
6. 慎重にnonmyocytesから心筋細胞を分離し、それらを30分間沈降させるために、15ミリリットルの遠心管の過5.0ミリリットル60μg/ mlのウシ血清アルブミン、BSAを、レイヤー。心筋細胞は重く、管の底部に移動する。慎重に上清を細胞および培地を除去します。さらに細胞を精製するために、一度、この手順を繰り返します。
7. 徐々に（0.25ミリモル、0.5ミリモル、0.75ミリモル、および緩衝液を含む1.0のCa ^{2 +を}用いて段階的に）を1.0mMのCa ^{2 +}緩衝液を含有するダルベッコ改変イーグル培地からなるACCT培地中に再懸濁する心室筋細胞/心筋細胞を洗浄することにより遷移DMEM、containingの2 mg / mlのBSA、2mMのL-カルニチン、5mMのクレアチン、5mMのタウリン、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン。
8. プレート100ミリメートルまたは35ミリメートルのラミニンコーティングされたプラスチック製の培養皿またはラミニン（個/ cm ^21μg）をでプレコート40×22ミリメートルのガラス製カバースリップ上/ mm ^2の 100から150個の細胞の密度でACCT培地中で心筋細胞。 1時間後、接続されていない細胞を除去するために2.0ミリリットルACCTで皿を洗う。新鮮な培地の10.0ミリリットルを加え、細胞を培養する。

ヒト気道上皮基底細胞の2。差別気液界面（ALI）文化

1. 治験審査委員会の下に国民病研究インターチェンジからのヒト気管気管支組織を調達するには、プロトコルを承認した。細胞回収および公開された手順^5,6を用いて培養を行う。彼らはTICをヒトの吸入曝露の正確なモデルであるため、この手順では、細胞培養を使用していますが、必要に応じて1アリMOで隔離し、成長することができます^7,8を使用および/ ​​またはラットの気道上皮細胞。
2. 簡単に言えば、すべての結合組織とリンパ節を除去した後の組織の小片（〜¼インチ）を作る。乳酸リンゲル液中に組織を数回洗浄します。 50ミリリットルコニカルチューブに組織を追加し、（最小必須培地、MEM、流体比（1:10）に対する組織の1％Protease/0.01％のDNA分解酵素）プロテアーゼ溶液を加える。
3. 一晩4℃で組織を揺する。 10％ウシ胎児血清を添加することにより、組織の解離を終了する。外科用メスで上皮表面をこすり、遠心分離（10分間2,000 RPM）で細胞を回収。
4. フルチャーら ⁹により詳細に記載されるように特別なALI培地中のコラーゲンコートスナップウェルに通路一方に板細胞を調製。頂端メディアを削除することによって気液界面（ALI）に変更する前に、5日間培養し。
5. （隔日ALI培地を用いて細胞を供給し、細胞をさらに2〜3週間の分化を可能にするエクスポージャーを実行する前に、数々の暴行繊毛や粘液分泌）を観察。メディアの変化と一緒に温かいPBSで頂端面を洗浄します。

3。塩素暴露

1. 偶然の塩素が漏れた場合に人員の露出を防止するために必要な二次封じ込めを提供100 FPMの運用面速度で修飾化学フード内の塩素露光システム（CES）が含まれている。
2. 若干の正の圧力（水の0.5インチ）の下でシステムを運用しています。乾燥空気は、15 L /分で供給される塩素の適切なレベルは、所望の最終塩素濃度を達成するために供給される。チャンバーは4ミニBCUロックと圧力シールを提供するために、低デュロメーターシリコーンガスケットと、ロック蓋を有する。
3. マスフローコントローラーを介してCl _2の混合物を提供します。 CESは乾燥窒素中のCl ₂ 1.0％を含むガスボンベを使用しています。
4. 使用した希釈空気の流れを調節するカスタムコントロールパネルを設計し、同様に露光チャンバに送達Cl ₂中の濃度を調節する。低容量サンプリングポンプは、次いで分析器に接続されたデータロガーに記録された濃度を監視するための塩素分析装置にチャンバからの排気を引く。
5. 露光前に等しく送達および排気速度を確保するために流量計を用いてチャンバ内の流速を測定する。
6. 上清培地を除去し、新鮮な培地（ALI培養における基底外側メディア）を追加することにより、露光のための細胞培養を準備します。薬との任意の前処理は、この時点で実行することができる。
7. 2密封されたポリスルホン生物学的封じ込め室にCl ₂ガス（30分50、100、または300 ppm）の気道上皮細胞のALI培養を公開します。心筋細胞（膜上の文化を水没やコンフルエント）を15分間50または100 ppmのClで₂にさらされている。
8. 暴露後のCまで、空気で室内をフラッシュl _2はレベルが1ppm以下に低下し、安全に（5分以内）の細胞を除去するために開くことができる。

4。経上皮電気抵抗（TER）測定

1. 気液界面のTER、アリ、塩化銀「箸」一対の電極を有する上皮voltohmmeterを使って文化を測定します。
2. 使用前に、ALIメディア15分で箸電極を平衡化させます。
3. 表面（2.0ミリリットル）（1.0ミリリットル）先端および側底に暖かいメディアを追加し、voltohmmeterの箸電極を用いてTERを測定します。
4. 頂端メディアにおける電極の短い腕と基底外側の媒体での長い腕を浸します。電気抵抗を評価するためにvoltohmmeterに「措置」ボタンをクリックしてください。
5. voltohmmeterはオームまたはkのオームを測定するためのオプションがあります。トランスを得るために、各細胞層全体に測定された抵抗からの無細胞培養支持体間の抵抗を引く上皮抵抗（TER）。

5。カスパーゼ測定

1. 基底外側表面の露光後に新鮮なALIメディア（2.0ミリリットル）を追加し、室温で細胞を培養する。 4および24時間後に上清メディアを収集します。
2. 商業カスパーゼ3/7アッセイキットを使用して、メディア上清中のカスパーゼ3/7活性を測定する。

6。ウエスタンブロットおよび免疫細胞化学

1. 以前に^10を説明したように細胞溶解物を用いたウエスタンブロットを実行します。 5×還元サンプル緩衝液中でタンパク質溶解物（20μgの）を一時停止し、5分間沸騰させる。 SDS-PAGE（4から15までパーセント）にタンパク質溶解物を対象とし、電気泳動ブロッティングによりニトロセルロース膜に分離したタンパク質を移す。
2. 洗浄緩衝液中の5％ミルク（PBS + 0.1％の界面活性剤）と共に膜をインキュベートすることによって非特異的結合をブロックし、4℃で一晩、1:1000希釈でSERCA2又はサルコメア·アクチンに対する一次抗体で膜をプローブ。次に、洗浄し、膜をインキュベートするそれぞれのペルオキシダーゼ結合二次抗体および市販のペルオキシダーゼ検出キットを用いて^、10前に説明したように検出用に開発する。
3. 免疫細胞化学のためにPBSでリンス後20分間、10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液中で0.4％トリトン-X-100で6ウェルプレートに挿入またはカバーガラス上で増殖させた生細胞を治療する。
4. 20分間、5％ロバ血清で細胞を処理することにより非特異的結合ブロックし、次いで、非特異的IgG又はサルコメア·アクチン又はKi-67の特有の個々の一次抗体で細胞をインキュベートする。
5. PBSで細胞を洗浄し、一次抗体および核染色（1μg/ mlのDAPI）を検出するために、蛍光結合二次抗体と共にインキュベートする。
6. PBSで洗浄し、商業封入剤を使用したカバースリップをマウントします。
7. 蛍光顕微鏡を用いて染色を可視化する。

結果

主な棒状の心筋細胞は、ラミニン行列やスプレッドに接続し、コンフルエントな培養物（ 図1Aおよびその挿入図）に分化する。これらの細胞はさらに筋節アクチンおよびSERCA2発現（ 図1Bおよび1C）に基づいて特徴づけた。ラットの心筋細胞は、ラミニンコーティングされた膜（ 図1D）上で増殖させた細胞に水没文化や融合性層の破壊で広範な...

ディスカッション

1が肺に有毒化学物質を呼吸する際に、急性毒性曝露の最も一般的なタイプが発生します。これらの化学物質はまた、迅速に血流中に取り込まれてもよく、例えば、脳や心臓などの他の臓器に影響を与えることができる。動物モデルを用いて種々の薬剤の吸入毒性が研究され、広く報告されている、しかし、メカニズムはあまりよく理解されている。これは効果的な治療法の開発に大きなハ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ