독성 흡입 화학 시험에 대한 시험 관내 세포 배양 모델에서

요약

이 프로토콜은 흡입 독성 화학 물질을 세포 배양의 노출 방법을 설명하기 위해 설계되었습니다. 차별화 된 공기 - 액체 인터페이스기도 상피 세포 (ALI) 문화의 노출은 염소와 같은 독성 가스에기도 노출의 독특한 모델을 제공합니다. 이 논문에서 우리는 염소 상피 세포의 공기 - 액체 인터페이스의 문화에 대한 노출과 심근의 침수 문화의 영향을 설명합니다. 체외 노출 시스템이 중요한 기전 연구는 다음 새로운 치료제를 개발하는 데에 이용 될 수있는 경로를 평가할 수 있습니다.

초록

세포 배양은 이전의 동물 모델에서의 사용에 대한 치료제의 효능을 개발하고 연구하는 것이 필수적이다. 우리가 잘 분화 된 인간기도 상피 세포와 심장 근육 세포를 모델링 할 수있는 독특한 기능이 있습니다. 이것은 일반적으로 세포 표면과 상호 작용하고, 물과 반응하고, 침수 문화에 미치는 영향을 제한에 따라 다양한 부산물을 형성 할 수있는 염소 등의 유해 화학 물질 흡입,의 해로운 효과를 연구하는 귀중한 도구가 될 수 있습니다. 공기 liqiuid 인터페이스에서 잘 분화 된 인간기도 상피 세포 배양을 이용하여 우리의 모델은 이러한 제한을 우회뿐만 아니라 잠재적 인 독성 흡입 화학 물질의 독성의 중요한 메커니즘을 평가하는 기회를 제공한다. 우리는 막 무결성의 강화 손실, 염소 노출 같은 독성 화학 물질 흡입시 카스파 릴리스과 죽음에 대해 설명합니다. 이 문서에서는, 우리는 포유 동물의 마음과기도 상피 C 염소 노출을 모델링하는 방법을 제안한다문화와 이러한 종류의 세포에 미치는 영향을 평가하는 간단한 테스트에서 ELL 학생.

서문

독성 화학 물질 흡입 (TICS)에 노출 / 염소 (망할 CIA ₂₎ 등의 가스 사고 피폭뿐만 아니라 화학 물질의 위협으로 자신의 잠재적 인 사용의 지속적인 건강 관심사 남아있다. 폐는 기본 목표이지만, 심장과 뇌 등의 장기는 생체 내 모델이 일반적으로 틱에서 테스트 독성에 사용됩니다. ^{1-3에 영향을하지만,} 독성 평가를위한 시험 관내 분석에서 비용 효과, 간단한 빠르고 더 있습니다됩니다.에서 체외 모델은 생체 내에서 평가하기 어려울 수 있습니다 에이전트 세포 상호 작용의 광범위한 조사를 할 수 있습니다. 이러한 체외 노출 시스템은 드물고 또한, 독성 에이전트가 세포가 침수되는 배양 배지에 첨가되는 일부 기존 모델에, 에이전트의 속성으로 인해 상호 작용과 매체의 구성 요소에 바인딩을 변경할 수 있습니다. 같은 이러한 시나리오 세포 배양 시스템에서 공기 - 액체 계면 (ALI직접 가스 에이전트에 노출 될 수 있습니다 여기에 제안 된 기본 인간기도 상피 세포의) 문화가 유망 될 수 있습니다.

기도를 안 감 상피 세포 흡입 독성 화학 물질에 대한 방어의 첫 번째 라인이다. 인간기도 상피는 폐의 루멘 및 기본 세포 사이의 물리적 장벽을 형성하고 폐의 응답에 참여하고 있습니다. 그것은 사이토 카인 및 기타 직업 및 항염증제의 수뿐만 아니라 상피 세포를 덮고있는 점액 /기도 표면 액체 (ASL)을 분비를 생성합니다. 체외 배양 시스템에 빠져들 기존의 한계 중 하나는 상피 표면을 커버 ASL과 점액을 제거하거나 희석하는 것도있다. 이것은 공기에 노출되어 폐 상피 세포의 생리 학적 상태를 반영하지 않는다. 따라서, TIC의 독성 시험에 대한 시험 관내 시스템에 이상적으로는이 아키텍처를 복제해야합니다. 빠른 심사 M을 개발에 큰 관심이 있습니다생체 내 독성 예측 ethods. ALI에서 성장 상피 세포는 차별화가 아니라 차별화 된 구조와 기능을 침수 성장 세포에 비해기도의 우수한 모델을 제공합니다.

이 연구에서, 우리는 인간의기도의 공기 - 액체 인터페이스 문화 유독 흡입 가스의 독성을 테스트 (기관지) 상피 세포의 사용을 설명하고, 따라서 독성의 또 다른 중요한 목표를 공부하고, 심근 세포의 침수 세포 배양과 비교.

프로토콜

1. 쥐 심근 문화

1. 모든 실험은 기관의 동물 관리 및 사용위원회, IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었다.
2. 이전에 ⁴ 설명한 방법을 사용하여 수컷 쥐의 마음 (심실) (2백40~2백60g)에서 쥐의 심근 세포를 얻습니다. (100 ㎎ / ㎏, 발가락 핀치 방법으로 마취를 확인) 간단히, 펜토 바르 비탈의 복강 내 주사를 사용하여 동물을 마취 한 후 10.0 ㎖, 크렙스 링거 버퍼, 산도 7.4를 포함하는 1 ㎜ 칼슘 ^{2 +에} 마음을 제거합니다.
3. 혈액을 제거하고 0.02 %의 단백질 분해 효소와 0.06 %의 콜라게나 제 (5.0 ㎖ / 마음)를 포함하는 칼슘 ^{2 +} 무료 크렙스 링거 버퍼로 전환 마음에게 5 - 6 배를 씻어. 가끔 흔들면서 37 ° C에서 10 ~ 15 분 동안이 솔루션의 마음을 품어.
4. 15 분 후, 추가로 5 분 동안 칼슘 ^{2 +} 무료 크렙스 링거 버퍼 효소 솔루션을 세척 할 것. 이완 된 조직을 우리로부터 세포를 해제위아래로 여러 번 현탁액을 피펫으로 25 ㎖의 피펫을 보내고.
5. 70 μm의 나일론 메쉬를 필터링하여 조직에서 세포를 분리하고 0.1 밀리미터 칼슘 ^{2 +를} 포함 크렙스 링거 버퍼에 정착 할 수 있습니다. 0.2 mM의 칼슘 ^{2 +를} 함유하는 1.0 ml의 크렙스 링거 완충액 세포 펠렛을 중지.
6. 조심스럽게 nonmyocytes에서 심근를 분리하고 30 분 동안 정착 할 수 있도록, 15 ML의 원심 분리기 튜브에 5.0 ㎖의 60 ㎍ / ㎖의 소 혈청 알부민, BSA를, 층. 심근은 무거워 튜브의 하단으로 이동합니다. 조심스럽게 뜨는 세포와 용지를 제거합니다. 또한 세포를 정화 한 번이 단계를 반복합니다.
7. 점차적으로 심실 근세포 / 심근 1.0 밀리미터 칼슘 ^{2 +} 포함하는 버퍼에 (0.25 ㎜, 0.5 ㎜, 0.75 ㎜, 1.0 밀리미터 칼슘 ^{2 +} 포함 된 버퍼를 사용하여 단계)의 세척 및 둘 베코의 수정 된 이글 매체로 구성된 ACCT 매체에 재현 탁으로 전환 , DMEM의 containiNG 2 ㎎ / ㎖ BSA, 2 MM의 L-카르니틴, 5 MM의 크레아틴, 5 mM의 타우린, 100 IU / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신.
8. 100mm 또는 35mm의 라미닌에 100-150 세포 / mm ^2의 밀도로 ACCT 매체에서 심근 플레이트 라미닌 (1 ㎍ / cm ^2)와 프리 코트 플라스틱 배양 접시 또는 40 X 22mm 유리 커버 슬립을 입혔다. 1 시간 후, 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 2.0 ml의 ACCT와 설거지. 신선한 매체의 10.0 ML을 추가하고 세포를 품어.

인간기도 상피 기저 세포의 2. 차별화 된 공기 - 액체 인터페이스 (ALI) 문화

1. 기관 평가위원회에서 국가 질병 연구 IC에서 인간의 기관지 조직을 조달 프로토콜을 승인했다. 세포 수확 및 게시 절차 ^5,6를 사용하여 배양을 수행합니다. 필요한 경우가 틱에 인간의 흡입 노출에 대한 정확한 모델이기 때문에이 과정은 세포 배양을 사용하지만, 하나는 분리하고 ALI 모 성장할 수및 / 또는 쥐의기도 상피 세포 ^7,8 사용합니다.
2. 간단히 말해서, 모든 결합 조직과 림프절을 제거한 후 조직의 작은 조각 (~ ¼ 인치)를 확인합니다. 락 테이트 링거액에 조직을 여러 번 씻는다. 50 ML 원뿔 튜브에 조직을 추가하고 (최소한의 필수적인 매체, MEM, 유체 비율 (1시 10분)에 조직을 1 % Protease/0.01 %의 DNA 분해 효소) 단백질 분해 효소 솔루션을 추가합니다.
3. 밤새 4 ° C에서 조직 록. 10 % 소 태아 혈청을 첨가하여 조직의 해리를 끝낸다. 수술 메스 상피 표면을 긁고 원심 분리 (10 분 2,000 RPM)에 의해 세포를 수집합니다.
4. 펄쳐 그 외 여러분 ^(9)에 의해 상세히 기술 된 바와 같이 제조 된 특수 ALI 매체 콜라겐 코팅 snapwells에 통과 한 곳에서 플레이트 세포. 혀끝의 미디어를 제거하여 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)를 변경하기 전에 5 일 동안 문화.
5. 모든 다른 일 ALI 미디어를 사용하여 세포를 공급하고 세포가 추가 2~3주 (위해 차별화 할 수노출을 수행하기 전에 다수의 박동 섬모와 점액 분비를) 관찰합니다. 미디어의 변화와 함께 따뜻한 PBS로 혀끝의 표면을 세척 할 것.

3. 염소 노출

1. 우발적 염소 누수 발생 인원의 노출을 방지하기 위해 필요한 이차 봉쇄를 제공 100 FPM의 동작면 속도로 정규화 화학 후드 안쪽 염소 노광 시스템 (CES)를 함유한다.
2. 약간의 정압 (물 0.5 인치)에서 시스템을 운영하고 있습니다. 건조 공기는 15 L / 분 및 염소가 원하는 최종 염소 농도를 달성하기 위해 공급된다의 적절한 수준으로 공급된다. 챔버는 4 미니 BCU 잠금 및 압력 밀봉을 제공하기 위해 낮은 경도의 실리콘 가스켓 잠금 뚜껑이 있습니다.
3. 질량 유량 제어기를 통해 망할 CIA ₂ 혼합물을 제공합니다. CES는 건조 _질소에 Cl2 1.0 %를 포함하는 압축 가스 실린더를 사용합니다.
4. 사용하여 희석 공기 흐름을 조절하는지정 조작부를 설계 마찬가지로 노광 챔버로 _전달에 Cl2 농도를 조절한다. 저용량 샘플링 펌프는 분석기에 접속 된 데이터 기록 장치에 기록 된 농도를 모니터링하는 염소 분석기로 챔버로부터 배기를 당긴다.
5. 노광에 앞서 동일한 배송 및 배기 속도를 보장하는 유량계를 이용하여 챔버 내에서 유량을 측정한다.
6. 뜨는 매체를 제거하고 신선한 미디어 (ALI 문화의 기저 미디어)를 추가하여 노출을위한 세포 배양을 준비합니다. 에이전트와 모든 전처리이 시간에 수행 될 수있다.
7. 두 개의 밀봉 된 폴리 설폰 biocontainment 실에서 Cl2 _가스 (50, 100, 또는 30 분 동안 300 PPM)에기도 상피 세포의 ALI 문화를 노출합니다. 심근 (침수 또는 점막에 문화를 컨 플루 언트)가 15 분 동안 50 또는 100 _PPM에 Cl2에 노출되어 있습니다.
8. 노광 후에 C까지 공기 실 플러시L ₂ 레벨은 1 PPM 이하로 안전하게 (5 분 이내) 세포를 제거하기 위해 열 수 있습니다.

4. Transepithelial 전기 저항 (TER) 측정

1. 공기 - 액체 계면의 TER을 측정 ALI 염화은 "젓가락"한 쌍의 전극과 상피 voltohmmeter를 사용하여 배양.
2. 사용하기 전에 ALI 미디어 15 분에 젓가락 전극을 평형.
3. 표면 (2.0 ㎖) (1.0 ㎖)을 정점 및 기저에 따뜻한 미디어를 추가하고 voltohmmeter의 젓가락 전극을 사용하여 TER을 측정합니다.
4. 혀끝의 미디어 전극의 짧은 팔과 기저 미디어에서 더 이상 팔을 찍어. 전기 저항을 평가하는 voltohmmeter에서 '측정'버튼을 클릭합니다.
5. voltohmmeter는 옴 K 옴을 측정 할 수있는 옵션이 있습니다. 거래를 수득 각 전지 층을 가로 질러 측정 된 저항에서의 무 세포 배양 지원 걸쳐 저항 빼기상피 저항 (TER).

5. 카스파 측정

1. 기저 표면 포스트 노출에 신선한 ALI 미디어 (2.0 ㎖)에 추가하고 실온에서 세포를 배양한다. 4, 24 시간에 뜨는 미디어를 수집합니다.
2. 상업적 카스파 3 / 7 분석 키트를 사용하여 미디어 상청액에서 카스파 3 / 7 활성을 측정한다.

6. 서쪽 오점 및 면역 세포 화학

1. 앞에서 설명한 ^10로 세포 용 해물을 사용하여 서양 말을 수행합니다. 5X 감소 샘플 버퍼에 단백질 용 해물 (20 μg)를 중단하고 5 분 동안 끓인다. SDS-PAGE (4 % -15 %)에 단백질 용 해물을 주제 및 전기 블로 팅에 의해 니트로 셀룰로오스 막으로 분리 된 단백질을 전송합니다.
2. 세척 버퍼 5 % 우유 (PBS + 0.1 % 세제)를 가진 막을 배양하여 비 특정 바인딩을 차단하고 4 ° C에서 하룻밤, 1:1,000 희석에 SERCA2 또는 sarcomeric 액틴에 대한 기본 항체 세포막을 조사. 다음, 세척 및 배양 세포막을 각각의 퍼 옥시 데이즈 - 복합 이차 항체 및 상업 과산화 효소 검출 키트를 사용하여 ¹⁰ 전에 설명한 바와 같이 검출을위한 개발.
3. 면역 세포 화학을 위해 PBS로 세척 한 후 20 분 동안 10 mM의 시트르산 나트륨 완충액에서 0.4 % 트리톤-X-100으로 10 - 웰 플레이트에 삽입하거나, 유리 커버 슬립 상에 성장 생균은 치료.
4. 블록 비특이적 20 분 동안 5 % 당나귀 혈청 세포를 치료하고 sarcomeric 말라 또는 KI-67에 특정 비 특이 IgG 또는 개별 차 항체와 세포를 배양하여 바인딩.
5. PBS로 세포를 씻어 차 항체 및 핵 얼룩 (1 ㎍ / ㎖의의 DAPI)을 감지하는 형광 - 복합 이차 항체와 부화.
6. PBS로 세척 및 상업 설치 미디어를 사용하여 커버 슬립을 탑재합니다.
7. 형광 현미경을 사용하여 염색을 시각화.

결과

기본 막대 모양의 심근은 라미닌 행렬에 연결하고 (그림 1A 및 삽입)를 확산하고 융합 문화로 분화. 이들 세포는 더 sarcomeric 액틴 및 SERCA2 식 (도 1B 및 1C)에 기초하여 특징으로 하였다. 쥐의 심근은 라미닌 코팅 된 멤브레인 (그림 1D)에 성장 세포에 잠긴 문화와 합류 층의 중단에 광범위한 세포 반올림과 죽음을 야기 100 ppm의 염소에 15 분 노출로 염?...

토론

하나는 폐에 유독 한 화학 물질을 호흡 할 때 급성 독성 노출의 가장 일반적인 유형은 발생합니다. 이러한 화학 물질은 신속하게 혈류에 흡수 될 수 있고, 뇌와 심장 등 다른 장기에 영향을 미칠 수 있습니다. 동물 모델을 사용하여 여러 에이전트의 흡입 독성을 연구하고 널리보고, 그러나 메커니즘은 덜 잘 이해된다. 이는 효과적인 치료 개발에 주요 장애물이다. 체외 노출 시스템의 부재는...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ