בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

Summary

פרוטוקול זה נועד להדגים שיטת חשיפה של תרביות תאים לכימיקלים רעילים בשאיפה. חשיפה של ממשק אוויר נוזלי מובחן תרבויות (עלי) של תאי אפיתל דרכי הנשימה מספקת מודל ייחודי של חשיפת דרכי הנשימה לגזים רעילים כגון כלור. בכתב יד זה אנו מתארים השפעה של חשיפת כלור בתרבויות ממשק אוויר הנוזלי של תאי האפיתל ותרבות שקועה של שריר לב. במבחנה מערכות חשיפה לאפשר מחקרים מכניסטית חשובים להעריך מסלולים כי אז יכול להיות מנוצל כדי לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים.

Abstract

תרביות תאים הן הכרחיות כדי לפתח ולחקור את היעילות של סוכנים טיפוליים, לפני השימוש בם במודלים של בעלי חיים. יש לנו את היכולת הייחודית למודל תאי אפיתל דרכי הנשימה האנושית ושריר לב מובחנים היטב. זה יכול להיות כלי רב ערך כדי לחקור את ההשפעות המזיקות של כימיקלים רעילים בשאיפה, כגון כלור, שיכולים בדרך כלל אינטראקציה עם משטחי התאים, ויוצרים תוצרי לוואי שונים על מגיב עם מים, ולהגביל את ההשפעות שלהם בתרבויות מתחת למים. המודל שלנו באמצעות תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות היטב בממשק אוויר liqiuid עוקף מגבלה זו, כמו גם מספק הזדמנות להעריך מנגנונים קריטיים של רעילות של כימיקלים בשאיפה רעילים פוטנציאליים. אנו מתארים אובדן משופר של שלמות קרום, שחרור caspase ומוות על כימי בשאיפה רעילה כגון חשיפת כלור. במאמר זה, אנו מציעים שיטות למודל חשיפת כלור בלב של יונקים ודרכי הנשימה אפיתל גאמות בתרבות ובבדיקות פשוטות כדי להעריך את השפעתה על אלו סוגי תאים.

Introduction

חשיפה לכימיקלים בשאיפה רעילה (טיקים) / גזים כגון כלור (Cl ₂₎ נשארה דאגה לבריאות מתמשכת בחשיפה מקרית, כמו גם בשימוש בם פוטנציאל כסוכן איום כימי. למרות הריאות הן היעד העיקרי, איברים כמו לב ומוח מושפעים גם ^1-3. בvivo מודלים משמשים בדרך כלל לבדיקת רעילות מטיקים, אבל במבחני חוץ גופית להערכת רעילות הם פשוט יותר, מהיר יותר וחסכוניים יותר. ב מבחנה מודלים גם לאפשר חקירה מקיפה של אינטראקציות סוכן תאים שעלולות להיות קשה להעריך in vivo. במבחנה מערכות חשיפה כזו הן נדירות ויותר מכך, בחלק מהדגמים קונבנציונליים שבו חומרים רעילים נוספים למדיום התרבות שבו תאים שקועים, את המאפיינים של הסוכנים יכולים להשתנות עקב אינטראקציות ומחייבים את רכיבים במדיום. במערכות כאלה תרחישי תא תרבות כגון ממשק אוויר נוזלי (ALIתרבויות) של תאים ראשוניים נשימה אנושית אפיתל, שהוצעו כאן, שיכול להיות חשוף ישירות לסוכנים של גזים יכולים להיות מבטיחות.

תאי האפיתל המצפים את דרכי הנשימה הם קווי ההגנה הראשונים נגד כימיקלים רעילים בשאיפה. אפיתל דרכי הנשימה האנושית מהווה מכשול פיזי בין לומן והתאים שבבסיס בריאה ומשתתף בתגובה של הריאות. היא מייצרת מספר ציטוקינים וסוכנים פרו ואנטי דלקתיים אחרים, כמו גם מפריש נוזל ריר פני השטח / בדרכי הנשימה (הגובה מעל פני הים) המכסה את האפיתל. אחת המגבלות בקונבנציונליות שקוע במערכות תרבות חוץ גופית הוא גם שהגובה מעל פני הים והריר שמכסים את פני השטח האפיתל מוסר או מדולל. זה אינו משקף את המצב הפיזיולוגי של תאי אפיתל ריאה שנחשפים לאוויר. לכן, אידיאלי במערכת מבחנה לבדיקת רעילות TIC צריך לשכפל ארכיטקטורה זו. יש עניין רב בפיתוח מ 'סינון מהירethods כי לחזות ברעילות vivo. תאי האפיתל גדלו בALI להבדיל ויש מבנים ופונקציות מובחנים היטב בהשוואה לתאים שגודל מתחת למים ולשמש מודל מעולה של דרכי הנשימה.

במחקר זה, אנו מתארים את השימוש של תרבות האוויר נוזלי ממשק של נשימה אנושית תאים (tracheobronchial) אפיתל לבדיקת רעילות גז בשאיפה רעילה ולהשוות אותו עם תרבית תאים שקועה של cardiomyocyte, ומכאן לומדים עוד יעד חשוב של רעילות.

Protocol

1. תרבויות העכברוש Cardiomyocyte

1. כל הניסויים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, IACUC.
2. השג שריר לב חולדה מהלב (חדרים) של חולדות זכרים (240-260 ז) תוך שימוש בשיטות שתוארו קודם לכן ^4. בקצרה, להרדים בעלי חיים באמצעות זריקת intraperitoneal של pentobarbital (100 מ"ג / קילוגרם; לאשר הרדמה בשיטת קמצוץ הבוהן) ולאחר מכן להסיר את לב ל10.0 מיליליטר, 1 מ"מ Ca המכיל חיץ קרבס רינגר, pH 7.4 ^{2 +.}
3. יש לשטוף את הלבבות 5-6x כדי להסיר דם ולאחר מכן לעבור ^{ל2 +} חיץ קרבס רינגר בחינם Ca מכיל פרוטאז 0.02% ו0.06% collagenase (5.0 מיליליטר / לב). דגירה את לבם בפתרון זה עבור 10-15 דקות ב 37 ° C עם רעד מדי פעם.
4. אחרי 10-15 דקות, לשטוף את הפתרון האנזימטית עם Ca ^{2 +} חיץ קרבס רינגר ללא תשלום עבור 5 דקות נוספות. שחרר את התאים מהרקמות הרפויותing פיפטה 25 מיליליטר ידי pipetting ההשעיה מעלה ומטה מספר פעמים.
5. הפרד את התאים מרקמות על ידי סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר ולאפשר להם להתיישב בחיץ קרבס רינגר המכיל 0.1 מ"מ Ca ^{2 +.} להשעות את התא גלולה ב1.0 מיליליטר חיץ קרבס רינגר המכיל 0.2 מ"מ Ca ^{+ 2.}
6. שכבה בזהירות מעל 5.0 מיליליטר 60 מיקרוגרם / מיליליטר שור אלבומין בסרום, BSA, ב15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, כדי להפריד בין שריר לב מnonmyocytes ולאפשר להם להתיישב למשך 30 דקות. שריר הלב הוא כבדים יותר ולעבור לחלק התחתון של הצינור. להסיר בזהירות את התאים ותקשורת supernatant. חזור על שלב זה פעם אחת כדי לטהר עוד יותר את התאים.
7. המעבר בהדרגה על ידי שטיפה (בצעדים באמצעות 0.25 מ"מ, 0.5 מ"מ, 0.75 מ"מ, ו1.0 מ"מ Ca ² חיץ ⁺ מכיל) myocytes / cardiomyocytes חדרית ל1.0 מ"מ Ca ^{2 +} המכיל חיץ וresuspended במדיום ACCT בהיקף של הנשר בינוני השתנה Dulbecco , Containi DMEMng 2 מ"ג / מיליליטר BSA, L-קרניטין 2 מ"מ, 5 מ"מ קריאטין, טאורין 5 מ"מ, 100 IU / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
8. פלייט שריר הלב במדיום ACCT בצפיפות של 100-150 תאים / מ"מ ² ב100 מ"מ או 35 laminin מ"מ מצופה צלחות פלסטיק תרבות או 40 x 22 coverslips זכוכית מ"מ precoated עם laminin (1 מיקרוגרם / ² סנטימטר). אחרי שעה 1, לשטוף את הכלים עם 2.0 מיליליטר ACCT כדי להסיר תאים שאינם מצורפים. הוספת 10.0 מיליליטר של תקשורת טרי ודגירת התאים.

2. ממשק האוויר נוזלי בדיל (ALI) תרבות של אדם תאי אפיתל Airway בסל

1. להשיג רקמות tracheobronchial אדם מלאומיים מחלת מחלף מחקר לפי סקירה מוסדית דירקטוריון פרוטוקולים. קציר תא ולבצע תרבות באמצעות ^5,6 הליך שפורסם. הליך זה משתמש בתרביות תאים כפי שהם מודל מדויק לחשיפות שאיפה אנושית לטיקים, עם זאת, במידת הצורך ניתן לבודד ולצמוח במו ALIשימוש ו / או תאי אפיתל דרכי הנשימה החולדה ^7,8.
2. בקצרה, להפוך את החתיכות קטנות (~ ¼ אינץ') של הרקמה לאחר הסרת כל צמתים רקמות הלימפה והחיבור. שטוף רקמה מספר פעמים בפתרון Lactated רינגר. הוספת רקמות לצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף פתרון פרוטאז (1% DNase Protease/0.01% בתקשורת מינימאלית חיונית, MEM, רקמת יחס נוזל (1:10)).
3. רוק הרקמות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בסופו של דיסוציאציה של הרקמה על ידי הוספת 10% בסרום שור העובר. לגרד את פני השטח אפיתל עם אזמל כירורגי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה (2,000 סל"ד 10 דקות).
4. פלייט תאים בקטע אחד בsnapwells מצופה קולגן במדיום ALI מיוחד שהכין כפי שתואר בפירוט על ידי Fulcher ואח' ^9. תרבות במשך 5 ימים לפני שינוי לממשק אוויר נוזלי (עלי) על ידי הסרת תקשורת הפסגה.
5. להאכיל את התאים באמצעות תקשורת ALI כל יום חלופי ולאפשר לתאים להתמיין ל2-3 שבועות נוספים (להתבונן cilia רב מכות והפרשת ריר) לפני ביצוע חשיפות. שטוף את משטח הפסגה עם PBS החם יחד עם שינויים בתקשורת.

3. חשיפת כלור

1. להכיל את מערכת חשיפת כלור (CES) בתוך מנדף כימי מוסמך עם תפעולי פני מהירות של 100 FPM המספק בלימה המשנית הדרושה כדי למנוע חשיפה של אנשים במקרים של דליפת כלור בשוגג.
2. להפעיל את המערכת תחת לחץ קל חיובי (0.5 סנטימטרים של מים). אוויר יבש מוזן ב15 ליטר / דקה ורמה מתאימה של כלור מוזן להשיג את ריכוז הכלור הסופי הרצוי. יש תאי מכסה נעילה עם 4 מנעולי BCU מיני ואטם סיליקון מד קשיות נמוך כדי לספק את חותם הלחץ.
3. לספק את תערובת Cl ₂ עד בקר זרימה המונית. CES משתמש בגליל גז דחוס המכיל 1.0% Cl ₂ בחנקן יבש.
4. להסדיר את זרימת אוויר הדילול באמצעותמעוצב בהתאמה אישית בלוח בקרה ובאופן דומה לווסת את הריכוז Cl ₂ נמסר לתאי החשיפה. משאבת דגימה בנפח נמוך מושכת את הפליטה מהתאים למנתח כלור כדי לפקח על ריכוזים שלאחר מכן נרשמו באוגר נתונים מחוברים למנתח.
5. למדוד את הספיקות בתוך התאים לפני החשיפה באמצעות מד זרימה כדי להבטיח את תעריפי משלוח ופליטה שווים.
6. הכן את תרביות תאים לחשיפה על ידי הסרת תקשורת supernatant ולהוסיף תקשורת טריות (מדיה basolateral בתרבויות ALI). כל pretreatments עם סוכנים יכול להתבצע בשלב זה.
7. לחשוף את תרבויות ALI של תאי האפיתל בדרכי אוויר לCl ₂ גז (50, 100, או 300 עמודים לדקה ל30 דקות) בשני חדרי biocontainment polysulfone אטומים. שריר הלב (מתחת למים או מחוברות תרבויות על קרומים) חשוף ל50 או 100 ppm Cl ₂ ל15 דקות.
8. לאחר החשיפה לשטוף את התאים עם אוויר עד Cl ₂ רמה יורדת מתחת לדקה 1 וניתן לפתוח בבטחה להסרת תאים (תוך 5 דקות).

4. Transepithelial חשמל התנגדות מדידה (TER)

1. מדוד את TER של אוויר נוזלי ממשק, עלי, תרבויות באמצעות voltohmmeter אפיתל עם זוג אלקטרודות כסף כלוריד "מקל".
2. לאזן את האלקטרודה המקל בדקות ALI תקשורת 15 לפני השימוש.
3. הוסף מדיה חמה למשטח הפסגה (1.0 מיליליטר) וbasolateral (2.0 מיליליטר) ולמדוד את TER באמצעות אלקטרודות המקל של voltohmmeter.
4. טובלים את הזרוע הקצרה של האלקטרודה בתקשורת הפסגה וזרוע ארוכה יותר בתקשורת basolateral. לחץ על כפתור ה 'המדד' בvoltohmmeter כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית.
5. יש voltohmmeter האפשרות למדוד אוהם או אוהם k. הפחת את ההתנגדות על פני תמיכה בתרבות תא ללא מהתנגדות שנמדדה על פני כל שכבת תא להניב טרנסהתנגדות אפיתל (TER).

5. מדידת caspase

1. הוסף מדיה טרי ALI (2.0 מיליליטר) לתפקיד חשיפת פני השטח basolateral דגירה התא בטמפרטורת חדר. לאסוף תקשורת supernatant ב 4 ו24 שעות.
2. מדוד caspase פעילות 3/7 בsupernatants התקשורת באמצעות caspase מסחרי 3/7 ערכת assay.

6. כתם מערבי וImmunocytochemistry

1. בצע כתמים מערביים באמצעות lysates תא ^כ10 שתוארו קודם לכן. להשעות את lysate החלבון (20 מיקרוגרם) ב5x חיץ מדגם מופחת ולהרתיח במשך 5 דקות. נושא lysate החלבון ל- SDS (4-15%) ולהעביר את החלבונים המופרדים לקרום ניטרוצלולוזה ידי סופג electrophoretic.
2. חסום את הלא ספציפי מחייב על ידי דוגרים הקרום עם חלב 5% בחיץ לשטוף (PBS + 0.1% חומר ניקוי) ולחקור את הקרומים עם נוגדנים ראשוניים כנגד SERCA2 או אקטין sarcomeric ב1:1,000 דילול, הלילה בשעה 4 ° C. בשלב הבא, לשטוף ודגירת קרומים עם הנוגדנים משני peroxidase-מצומדות בהתאמה ולפתח עבור זיהוי כפי שתואר קודם ¹⁰ באמצעות ערכת זיהוי peroxidase מסחרית.
3. לimmunocytochemistry טיפול בתאי חיים שגדלו על מוסיף או coverslips זכוכית 6 צלחות היטב עם 0.4% Triton-X-100 ב10 חיץ ציטרט הנתרן מ"מ עבור 20 דקות לאחר שטיפה עם PBS.
4. בלוק ספציפי מחייב על ידי טיפול בתאים עם 5% בסרום חמור עבור 20 דקות, ולאחר מכן דגירה התאים עם IgG אינו ספציפי או נוגדנים עיקריים אדם ספציפי ליקטין sarcomeric או קי 67.
5. לשטוף את התאים עם PBS ו דגירה עם נוגדנים משני ניאון מצומדות כדי לזהות את הנוגדן הראשוני וכתם גרעיני (DAPI מיקרוגרם / מיליליטר 1).
6. לשטוף עם PBS והר coverslips באמצעות תקשורת הרכבה מסחרית.
7. דמיין את ההכתמה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

שריר לב בצורת מוט עיקרי לצרף במטריצות laminin והתפשט ולהתמיין לתרבויות מחוברות (איור 1 א והבלעתה). תאים אלה מתאפיינים נוספים על הבסיס אקטין sarcomeric וביטוי SERCA2 (איורים 1B ו 1C). שריר לב חולדה הוא רגיש מאוד להרעלת כלור כ15 חשיפת דקות ל100 כלור עמודים לדק?...

Discussion

הסוג הנפוץ ביותר של חשיפות רעילות אקוטיות מתרחש כאשר אחד נושם כימי רעילה לריאות. כימיקלים אלו יכולים גם להיות שנלקחו במהירות במחזור הדם ועלולים להשפיע על איברים אחרים כגון מוח ולב. רעילות שאיפה של סוכנים שונים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים נלמדות ודווחה בהרחבה, לעו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ