القياس الآلي من الأوعية الدقيقة سرعة تدفق الدم في الرئة الانبثاث من الجرذان

Summary

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Abstract

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Introduction

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protocol

ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوانية المتعلقة الموصوفة في هذا البروتوكول وقد تمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ديوك (DUIACUC).

1. سرطان خلية ثقافة وحقن

1. زراعة خلايا السرطان النقيلي fluorescently المسمى (على سبيل المثال MDAMB231-GFP خلايا سرطان الثدي البشرية، هدية من الدكتور باتريشيا Steeg، NCI، وخلايا فأر ساركوما YFP المسمى، هدية من الدكتور ديفيد كيرش، المركز الطبي لجامعة ديوك، قسم علاج الأورام بالإشعاع) في مستنبت المناسب (على سبيل المثال Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / streptavidin) عند 37 درجة مئوية حتى ما يقرب من 90٪ متموجة.
2. يعرض للتريبسين الخلايا، غسلها 2 مرات مع برنامج تلفزيوني، عد، ثم ضخها في عروق الذيل من 10 أسابيع من العمر الفئران عارية الإناث تخدير الأيزوفلورين عند 5 مليون خلية لكل حيوان، وذلك باستخدام حقنة بإبرة G 27. anesthes مستوى الجراحيةيتم التحقق منها الجيش العراقي بسبب عدم وجود رد فعل حتى أخمص القدمين قرصة.

2. رصد الانبثاث عن طريق MicroCT

1. دراسة الفئران مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الصغير CT / الدقيقة Irradiator، للكشف عن وجود نقائل فوق ما يقرب من 2 مليمتر في القطر في القطر. وكلفت-CT الجزئي كما هو موضح سابقا ^(12).
   1. الفئران الخاضعة لل3٪ الأيزوفلورين التخدير قبل التصوير. تأكيد التخدير العميق عن طريق قرصة أخمص قدميه.
   2. بعد بداية التخدير، وبسرعة نقل الفئران إلى مهد التصوير في غرفة التصوير والاتصال عن طريق الأنف مخروط إلى خليط الأيزوفلورين الهواء في 2.5-3٪. ضبط الموقف من الفئران في المهد في الطريقة التي يتم وضع الصدر في شعاع الفوتون من الماسح الضوئي MicroCT، باستخدام عناصر التحكم موقف الخارجية ومحدد ليزر على مهد التصوير. تأكد من إغلاق الباب إلى غرفة التصوير، لحماية المحقق من أشعة غاما.
   3. السيطرة على الموقف من الحيوان مرة أخرى باستخدامالكاميرا لون الفيديو. إجراء منخفضة الدقة اختبار التصوير CT المدى، واستخدام الصورة الناتجة لضبط مجال الرؤية للأبعاد XYZ من التجويف الصدري.
   4. صورة الصدر الفئران باستخدام 2 مم آل مرشح في 40 KVP، 2.5 مللي أمبير، وفوكسل 0.008 في 7 FPS ويعود الحيوان إلى قفصه. التصوير من حيوان واحد ينبغي أن لا يزيد عن 15 أو 20 دقيقة. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية.
   5. تأكيد الانبثاث بظهور أجسام معتمة نسبيا التي لا يمكن تفسيرها من خلال الأوعية الدموية داخل الصدر (الشكل 1A)

جراحة 3. غرفة النافذة

1. التخدير، والعلامات الحيوية والذيل قثطرة الوريد
   1. اختيار الحيوانات مع وجود المرض المنتشر. حقن الحيوان مع د داخل الصفاقبيئة نظام التشغيل من 50 ملغ / كغ بنتوباربيتال. تأكيد التخدير على مستوى الجراحي بواسطة إصبع قرصة قبل المتابعة.
      يجب أن تكون مطابقة بروتوكولات التخدير إلى الإعداد التجريبية منها: مذكرة. وقد تم اختيار بنتوباربيتال هنا كما مخدر طويل المفعول، وذلك للحث على التخدير العميق لإجراءات مطولة، في حين تقدم خيار السطحية إعادة الجرعات. ومع ذلك، وفقدان الحيوانات لالجرعة الزائدة هي مشكلة مشتركة مع التخدير بنتوباربيتال. وثمة خيار آخر أن يحافظ على ردود الفعل اللاإرادي إلى درجة أكبر من بنتوباربيتال هو الكيتامين في تركيبة مع المهدئات مثل زيلازين أو medetomidine، ولكن الذي يسمح فقط للملء مع جرعة إعادة دورة واحدة.
   2. يحلق الحيوانات على جانب من الجسم الذي لديه المرض المنتشر، وفي منطقة الرقبة، وذلك باستخدام المقص. تمحو كل ما تبقى من الشعر فضفاضة من الجلد. بعد إزالة الشعر فضفاضة، وتطبيق مرهم البيطرية للعيون، لمنعهم من الجفاف.
      ملاحظة: قد يكون الفئران عارية Athymic الشعر المتبقية التي REQUIإزالة الدقة قبل الشروع في العمليات الجراحية. من المهم جدا لإزالة كل الشعر جيدا، لأنها قد تتداخل مع العمليات الجراحية والتصوير.
   3. إصلاح الحيوان في موقف ضعيف على لوحة معدنية التي يتم وضعها على وسادة التدفئة 37 ° C المياه تعميم. يتم إصلاح الأطراف الأمامية والخلفية على لوحة مع الشريط.
      ملاحظة: ومن المفيد لمراقبة وتسجيل العلامات الحيوية، مثل معدل ضربات القلب والشرايين الأوكسجين في الدم باستخدام مقياس التأكسج النبض، في جميع أنحاء العمليات الجراحية والتجريبية.
2. التنبيب الرغامي
   1. من أجل وضع قسطرة للتهوية من الحيوان، أولا جعل مستعرضة عنق الرحم شق الجلد، يليه فصل متوسط ​​من بطني عضلات طولية إلى القصبة الهوائية.
   2. الاستخدام المتكرر العمل الافتتاحية إلى إغلاق مع ملقط حادة لإنشاء ممر للخياطة من خلال الجانب الظهري من القصبة الهوائية.
   3. إجراء شق صغير في القصبة الهوائية على رانه الجانب البطني، وليس أكثر من نصف دائرية، ما يقرب من بين القصبة الهوائية حلقة الثانية والثالثة. ترك جزء طويل بما فيه الكفاية من القصبة الهوائية تعرض على السطح الظهري، لتمكين تثبيت القسطرة القصبة الهوائية.
   4. إدراج 2،5-3،0 مم "Y" القصبة الهوائية قنية في القصبة الهوائية، وتشديد مع خياطة 4-0 حيدة. ضمان توصيل قنية لضغط تدوير التنفس الصناعي مع زجاجة متصلة القناة انتهاء مليء 6 سم من الماء، للحفاظ على الضغط الرئوي الإيجابي. وينبغي أن يكون الغاز المتدفق 100٪ الأكسجين، ما لم المطلوب تجريبيا على خلاف ذلك.
   5. ادخال قسطرة مع G إبرة 25-27، ومليئة المالحة heparinized إلى واحدة من الأوردة ذيل فأر، وإصلاح في مكان مع الشريط.
      ملاحظة: تأكد من المباح للقسطرة الوريد الذيل في جميع أنحاء الإجراء من قبل مرارا وتكرارا حقن كمية صغيرة من المياه المالحة heparinized في الوريد الذيل. أيضا، التنبيب أورو-القصبة الهوائية، أي توجيه من القصبة الهوائيةأنبوب عن طريق الفم للتخدير الحيوان والماضي الحنجرة إلى القصبة الهوائية، هو بديل محتمل لإجراء القصبة الهوائية الموضح هنا. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب من التدريب والخبرة خاص، لتجنب الأضرار التي لحقت القصبة الهوائية، وأيضا للحيلولة دون القسطرة عرضي من المريء.
3. تطبيق نافذة الرئوي
   1. إزالة الجلد من الجانب من الصدر حيث يقع المرض المنتشر، من خلال خلق شق، ومن ثم فصل الجلد باستخدام تشريح حادة.
      ملاحظة: الجلد يمكن رفعه وإزالة لاحقا إلى مفرزة
   2. المضي قدما في طريق تشريح طبقتين من تتراكب الجهاز العضلي (الصدرية، المنشارية، والظهرية العريضة)، ولكن ترك العضلات الوربية سليمة. إنشاء ثقب في تجويف الصدر من حوالي 1.5 سم في القطر، عن طريق إزالة أجزاء من عادة اثنين من أضلاعه المجاورة. من الناحية المثالية، حدد موقع ثقب في المنطقة من ص السادس والسابعالقولون العصبي.
   3. العظم:
      1. لتقليل النزيف والضرر على سطح الرئة، وعقد بإحكام الضلع لا بد من تخفيض مع ملقط الجراحية مسننة خلال عدة قطاعات. باستخدام مقص جراحي، وقطع الجانب الإنسي من الضلع الأول، في زاوية ما يقرب من 45 درجة، وترك الجانب أشار من عظم الضلع المتبقي لافتا الخارج.
      2. وفي وقت لاحق، وقطع الجانب الوحشي من عظم الضلع بطريقة مماثلة، وترك مرة أخرى الجانب أشار العظم الصدري إلى الخارج، لمنع الأضرار التي لحقت سطح الرئة.
      3. كرر الإجراء الضلع المجاور، ثم قطع العضلات الوربية وإزالة قطعة رفعه. خلال هذا الإجراء، والحفاظ على ضغط الرئة بطريقة التفاعل الميكانيكية بين سطح الرئة والقفص الصدري إلى أدنى حد ممكن. القيام بذلك عن طريق تنظيم ضغط بشكل مناسب إلهام على جهاز التنفس الصناعي.
   4. الإدراج من النافذة:
      1. اضافة الى وجود نافذة الرئة العرف، ويتكون من ساترة هذا هوتعلق على مقبس زجاجي (الشكل 1B). نعلق الإطار إلى المقبس من قبل الإلتصاق، أو عن طريق تطبيق كمية صغيرة جدا من الشحوم فراغ. إدراج النافذة بطريقة الانبثاث سطح تقع على مقربة من وسط النافذة. إذا لزم الأمر، وضبط فتحة إدخال لجلب نقيلة مجهرية إلى وسط النافذة من خلال توسيع الثقب قليلا إلى الجانب المعني.
         ملاحظة: المرض المنتشر على سطح الجنبي يمكن حصرها في النقاط البيضاء التعرف عليها بوضوح أو مناطق داخل أجزاء خلاف الوردي لسمك السلمون الملونة صحية من سطح الرئة التي تظهر في الغالب على طول الشقوق. في حين يمكن أن يحدث micrometastases على مناطق أخرى من الخارج الجنبي، وخطوط الخلايا التحقيق عرض دائما تقريبا تطفو على السطح micrometastases في منطقة مثقبة، مرة واحدة المرض المنتشر يمكن أن يتم الكشف عن شعاعيا.
      2. بعد إدخال المقبس في ثقب، وخلق اتصال مباشر مع الجنبة الحشوية لللأونج، خياطة حواف إطار نافذة لعضلة الوربية المحيطة، وذلك باستخدام 4.0 خياطة حيدة (الشكل 1C). استخدام زيادة طفيفة الضغط إلهام على جهاز التنفس الصناعي للمساعدة في الهواء المتبقية للهروب وخلق الختم.
         ملاحظة: معدل التنفس من الفئران يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا، تبعا لحالة من التخدير، وحالة من الإثارة أو القلق، وتركيز الأكسجين من الهواء من وحي (قوة المراقبة الدولية _2)، وما إلى ذلك من المفضل لضبط معدل التنفس ما بين 70 و 90 نبضة في الدقيقة. ينبغي تعديل الضغط إلهام بحذر وعدم وضعها لأكثر من تقريبا. 8 سم H ₂ O (0.6 ملم زئبقي)، لتجنب الأضرار التي لحقت سطح الرئة.
   5. وضع الحيوان في رادع مصمم خصيصا التي تم تصميمها للقضاء-Z اتجاهي الحركة (الشكل 1D) على لوحة الصلب الذي يتوضع على الحرارية (الكهربائية) التدفئة بطانية، تحت المجهر مضان. السيطرة على جسم الحيواندرجة الحرارة باستخدام الثرمستور المستقيم. ضبط مسامير من رادع الحيوان، والضغط إلهام على جهاز التنفس الصناعي لتحقيق التحكم الأمثل من الحركة الجانبية.
      ملاحظة: التنفس الطبيعي في الثدييات يشمل جميع الاتجاهات الثلاثة للحركة الرئة والإرشاد الصدر: الثنائي، ظهراني بطني، والقحف-الذيلية. من أجل الحفاظ على حركة التنفس الطبيعية قدر الإمكان، من المهم للحد-Z الاتجاه ضغط بالقدر اللازم. لأن Z-الأبعاد ضبط النفس لديه القدرة على تقديم الاعمال الفنية التي قد تؤثر على تدفق الدم وغيرها من المعالم، فمن المستحسن أن تبقي شروط ثابتة خلال سلسلة من القياسات المتكررة في نفس الحيوان.

4. التصوير والقياس من الأوعية الدقيقة تدفق الدم

1. جمع خلايا الدم الحمراء عبر ثقب في القلب وتسمية لهم الجاذبة (1،1 = -dioctadecyl-3،3،3 بيركلورات = 3 = -tetramethyl-indocarbocyanine)، كما هو موضح سابقا <سوب> 10.
2. ضخ 300 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء وصفت في الوريد ذيل فأر قبل الجراحة تتم غرفة النافذة، لتجنب الآثار الأولى تمريرة التصاق لزجاج النافذة. القضاء على أي فقاعات الهواء في حقنة أو القسطرة، كما إدخال الهواء إلى الوريد سوف تمنع أي حقن أخرى.
3. صورة تدفق الدم مع كاميرا CCD المجهر في -40 ° C رقاقة درجة حرارة التبريد، وحوالي 100X قرار الكلي (أي مع الهدف المجهر 10X، 10X وقبل الكاميرا بصري). استخدام معيار مجموعات تصفية رودامين / TRITC (450-490 نانومتر الإثارة، والانبعاثات> 515 نانومتر). تسجيل معدل الإطار وبكسل القرار الفعلي للتسلسل الصورة الناتجة. سجل 200 على الأقل (من الناحية المثالية حوالي 300) الصور في كومة، لضمان التحليل الناجح لسرعة التدفق.
4. تجديد فقدان السوائل في الحيوان عن طريق ضخ ما يقرب من 1 مل من المياه المالحة الملكية الفكرية في كل ساعة.
   ملاحظة: إعدادات التجريبية التي تنطوي على التدخل، على سبيل المثالدواء بتعديل سرعة تدفق الدم في الانبثاث السرطان الرئوي، يتطلب قياسات متكررة من سرعة تدفق الدم في السرطان النقيلي الرئوي. لهذه التجارب الموسعة، من المهم لتجديد الحيوان مع السائل كافية.
5. الموت ببطء الحيوانات عن طريق التسريب من 3 مل من 3N بوكل في الوريد الذيل
6. تقييم مداخن صورة باستخدام، وهي متاحة علنا خوارزمية الكمبيوتر نشرت استنادا ماتلاب من شأنها أن تخلق تدفق الرمادي السرعة واللون المشفرة خرائط لجميع تدفق الدم يتتبع ^10،11. تقييم في وقت لاحق الصور الرمادية الناتجة باستخدام برنامج تحليل الصور تجاري أو متاحة للجمهور، مثل صورة J، بعد العتبة من القيم التي تشير إلى أي حركة خلايا الدم، أي لا الأوعية الدموية نشطة.

النتائج

ومن المعروف أن الأوعية الدموية في الأورام الصلبة لتختلف كثيرا عن إمدادات الدم الطبيعي، والتي تبين درجة أكبر من تعرج، والمسافات INTERVASCULAR أعلى ^13. وفقا لذلك، والمسارات تدفق الدم في الرئة التجريبية سرطان الثدي وساركوما الانبثاث لها الأشكال غير النظامية والثغرات INT...

Discussion

ويرد النموذج الذي هو ممكن للتغيرات الصورة في الأوعية الدقيقة تدفق الدم والعمليات الحيوية الأخرى في الانبثاث الرئة من الفئران، وذلك باستخدام intravital المجهري والتحليل الحسابي تدفق الدم. بينما توجد طرق أخرى لأداء المجهري على الرئتين تتعرض في ribcages مفتوحة من القوارض، وهذ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope