Автоматическое измерение микроциркуляции крови скорость потока в легочных метастазов у ​​крыс

Резюме

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Аннотация

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Введение

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, связанные описанные в этом протоколе были ранее утверждены Уходу за животными и использованию комитета Университет Дьюка (DUIACUC) по.

1. Рак клеточной культуре и впрыска

1. Развивайте флуоресцентно меченных метастатических раковых клеток (например, человека MDAMB231-GFP клетки рака молочной железы, подарок от доктора Патриции Steeg, NCI, и YFP меченных мыши клеток саркомы, подарок от д-ра Дэвида Кирша, Duke University Medical Center, отдел радиационной онкологии) не в соответствующей культуральной среде (например, Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептавидин) при 37 ° С до примерно 90% сплошности.
2. Trypsinize клеток, мыть их два раза с PBS, граф, а затем ввести их в хвостовую вену изофлурановой анестезии-10 недель самок голых крыс при 5000000 клеток на животное, с помощью шприца с иглой 27 G. Anesthes Хирургические уровняИ. А. проверяется отсутствие реакции на носок крайнем случае.

2. Мониторинг метастазов Использование MicroCT

1. Изучение крыс один раз в неделю с помощью микро-CT / микро-облучатель, чтобы обнаружить присутствие метастазов выше примерно 2 мм в диаметре в диаметре. Микро-КТ в эксплуатацию, как описано выше ^12.
   1. Тема крысы до 3% ИФ анестезии до визуализации. Подтвердите глубокую анестезию пальца щепоткой.
   2. После начала наркоза, быстро передавать крыс колыбели изображений в камере изображений и подключения через носовой конус к ИФ-воздушной смеси на 2,5-3%. Отрегулируйте положение крысы в ​​колыбели таким образом, что его грудная клетка, расположенного в фотонном пучке MicroCT сканера, используя внешнее управление позиции и лазерной разделитель на подставке изображения. Убедитесь, дверь в камеру изображения закрыта, чтобы защитить следователь из гамма-лучей.
   3. Управление позицию животного еще раз с помощьюцветная видеокамера. Выполните пробную КТ изображения бежать с низким разрешением, а также использовать полученное изображение, чтобы отрегулировать поле зрения с XYZ размеров грудной полости.
   4. Изображение крысы грудной клетки с использованием 2 мм Al фильтра на 40 кВп, 2,5 мА, и 0,008 воксел на 7 FPS и вернуть животное в клетку. Визуализация одного животного следует принимать не более 15 или 20 мин. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью выздоровел. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение.
   5. Подтвердите метастазы появлением относительно рентгеноконтрастных объектов, которые не могут быть объяснены внутригрудных сосудов (1А)

3. Окно палата хирургии

1. Анестезия, жизненно важных функций и хвостовую вену катетеризации
   1. Выберите животных с наличием метастазов. Вводят животное с внутрибрюшинного DOSE 50 мг / кг фенобарбитала. Подтвердите хирургическое уровня анестезии пальца щепоткой прежде чем продолжить.
      Примечание: протоколы анестезии должен быть согласован с соответствующей экспериментальной установки. Пентобарбитал был выбран здесь как длительного действия анестетика, для того, чтобы вызвать глубокий наркоз для длительных процедур, а также предложить возможность легкому повторного введения. Тем не менее, потеря животных передозировки является общей проблемой с анестезией пентобарбиталом. Другой вариант, который сохраняет вегетативные рефлексы в большей степени, чем фенобарбитала является кетамин в сочетании с седативными средствами, такими как ксилазина или медетомидина, который, однако, позволяет только для одного повторного дозирования цикла.
   2. Бритье животных на стороне тела, что имеет метастазы, и в области шеи, используя машинку. Протрите все оставшиеся свободные волосы с поверхности кожи. После распущенные волосы удаляют, применять ветеринарный мазь для глаз, чтобы предотвратить их от высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: бестимусных голых крыс могут иметь остаточную волосы, которые requiУдаление разрешения, прежде чем приступить хирургических процедур. Это очень важно, чтобы удалить все волосы тщательно, так как это может помешать хирургических процедур и визуализации.
   3. Fix животное в положении лежа на спине на металлической пластине, которая находится на 37 ° C вода циркулирует грелку. Передние и задние конечности крепятся на пластине с лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это полезно для контроля и записи жизненно важные признаки, такие как частота сердечных сокращений и артериального оксигенации крови с помощью пульсоксиметра, на протяжении хирургических и экспериментальных процедур.
2. Интубация трахеи
   1. Для того чтобы разместить катетер для вентиляции животного, сначала сделать поперечное шейки разрез кожи с последующим разделением средней продольной мускулатуры брюшной части трахеи.
   2. Используйте многократного действия открытие к закрытию при резком щипцов для создания прохода для шва через спинной стороне трахеи.
   3. Сделайте небольшой надрез в трахее на Т-Он вентральной стороне, не более чем полукруглое, примерно между второй и третьей кольца трахеи. Оставьте достаточно длинный участок трахеи воздействию на дорсальной поверхности, чтобы включить фиксацию катетера трахеи.
   4. Вставьте 2,5 мм до 3,0 мм "Y" трахеи канюли в трахее и затяните с 4-0 мононити шва. Обеспечить канюли соединен с вентилятором на циклическое изменение давления с бутылкой, подключенного к каналу годности, который наполнен 6 см воды, чтобы поддерживать положительный легких давление. Втекающая газ должна быть 100% кислорода, если экспериментально не желал иначе.
   5. Вставка катетера с 25-27 G иглы, и заполнены гепаринизированной физиологического раствора в один из хвостовых вен крысы, и закрепить в месте с лентой.
      Примечание: Обеспечить проходимость хвостовой вены катетер в течение всей процедуры, неоднократно инъекционных небольшое количество гепаринизированной физиологического раствора в хвостовую вену. Кроме того, орально-интубации трахеи, т.е. руководством трахеиТрубка через рот анестезированных животных и мимо гортани в трахею, является возможной альтернативой процедуре трахеотомии, описанной здесь. Тем не менее, этот метод требует специальной подготовки и опыта, чтобы избежать повреждения трахеи, а также исключает случайное катетеризации пищевода.
3. Применение легких окне
   1. Удалить кожу со стороны грудной клетки, где метастазы находится, создавая разрез, а затем снятие кожи с использованием тупым.
      Примечание: кожа может быть вырезан и удален после отрыву
   2. Перейдите по рассекает два слоя наложенного мускулатуры (грудной, зубчатой ​​и широчайшие мышцы спины), но оставляя межреберные мышцы нетронутыми. Создание перфорации в грудной полости приблизительно 1,5 см в диаметре, путем удаления части обычно два смежных ребра. В идеале, найдите перфорации области шестого и седьмого RIBS.
   3. Osteotomy:
      1. Чтобы свести к минимуму кровотечение и повреждение поверхности легких, плотно удерживать ребро быть сокращены с зубчатыми хирургических щипцов во время резки. Использование хирургических ножниц, разрезать медиальной стороне ребра первых, под углом примерно 45 °, в результате чего заостренный сторону оставшегося грудной кости, указывая на улице.
      2. Впоследствии, сократить боковой стороне грудной кости таким же образом, снова оставляя острый сторону грудной кости, указывая наружу, чтобы предотвратить повреждение поверхности легких.
      3. Повторите процедуру для прилегающей ребра, а затем вырезать межреберные мышцы и снять вырезали кусок. Во время этой процедуры, поддерживать давление легких таким образом, что механическое взаимодействие между поверхностью легких и грудной клетки сводится к минимуму. Для этого соответствующим образом регулируя вдохновение давление на искусственной вентиляции легких.
   4. Вставка из окна:
      1. Вставьте на заказ окно легких, состоящая из покровного стекла, что являетсяприсоединен к разъему плексигласа (Фиг.1В). Установите окно в гнездо склеиванием или путем применения очень небольшое количество вакуумной смазки. Вставка окно таким образом, что поверхностные метастазы расположены близко к центру окна. Если необходимо, отрегулируйте вставленный дыру, чтобы принести микрометастазов в центре окна, увеличивая отверстие слегка соответствующей стороны.
         ПРИМЕЧАНИЕ: метастатической болезни на плевральной поверхности могут быть определены как явно узнаваемых белых точек или областей, расположенных в противном случае от розового до лосось цветных здоровые части поверхности легких, которые появляются преимущественно по трещинам. В то время как микрометастазов может произойти на других участках плевральной внешний вид, исследованные клеточные линии почти всегда отображать наплавки микрометастазов в перфорированной области, когда метастазы могут быть обнаружены рентгенологически.
      2. После установки гнездо в перфорации, а также создание прямой контакт с висцеральной плевры лУн, шов края оконной рамы к окружающей межреберных мышц, используя 4,0 мононити шов (рис 1в). Используйте небольшое увеличение давления вдоха на искусственной вентиляции легких, чтобы помочь остаточный воздух, чтобы избежать и создать уплотнение.
         Примечание: частота дыхания у крыс может сильно варьироваться, в зависимости от состояния анестезии, состояние возбуждения или тревоги, концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе (FiO _2), и т.д., рекомендуется настроить частоту дыхания между 70 и 90 ударов в минуту. Давление вдохновение должны быть скорректированы с осторожностью и не быть установлен в более прибл. 8 см H ₂ O (0,6 мм рт.ст.), чтобы избежать повреждения поверхности легких.
   5. Расположите животное в специально разработанной фиксатор, который предназначен для устранения Z-направленного движения (рис 1D) на стальную пластину, которая расположена на термостатический (электрический) одеяло отопления, под флуоресцентным микроскопом. Управление тело животноготемпературы с помощью ректального термистор. Отрегулируйте винты животного фиксатор, и давление вдохновение на искусственной вентиляции легких для достижения оптимального контроля бокового движения.
      Примечание: естественное дыхание у млекопитающих включает все три направления движения легких и расширение грудной клетки: двусторонняя, спинно-брюшного и черепно-хвостовой. Для того чтобы сохранить естественное движение дыхания, насколько это возможно, важно, чтобы свести к минимуму Z-направленного сжатия в необходимом объеме. Поскольку Z-мерное удерживающее имеет потенциал, чтобы представить артефакты, которые могут повлиять на кровоток и другие параметры, желательно, чтобы постоянная условий во серии повторных измерений в одной и той же животного.

4. Работа с изображениями и измерения микроциркуляции кровотока

1. Собирают клетки крови с помощью пункции сердца и маркировать их с DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = тетраметил-индодикарбоцианинового перхлорат), как описано ранее ^10.
2. Вводят 300 мкл меченых эритроцитов в хвостовую вену крысы перед окном камеры операция выполняется, чтобы избежать первого прохода адгезии эффекты на оконное стекло. Ликвидировать все пузырьки воздуха в шприце или катетера, как введение воздуха в вену будет препятствовать какие-либо дополнительные инъекции.
3. Изображение кровотока с ПЗС-камеры микроскопа при -40 ° С температура охлаждающей чипа, и примерно 100X целом разрешение (т.е. с объектива микроскопа 10X, 10X и до камеры глазного). Используйте стандартные наборы Rhodamine / TRITC фильтра (возбуждение 450-490 нм, эмиссия> 515 нм). Запишите фактически используемой частоты кадров и разрешение пиксела получаемых в виде последовательности изображений. Запись по крайней мере, 200 (в идеале около 300) кадров стека, чтобы обеспечить успешное анализ скорости потока.
4. Пополнить потери жидкости у животного путем введения примерно 1 мл физиологического раствора IP каждый час.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные установки, которые включают вмешательства, например,Препарат, который изменяет скорость кровотока в легочной метастазов рака, требует повторных измерений скорости кровотока в легких метастатическим раком. Для этих расширенных экспериментов, важно, чтобы пополнить животное с достаточной жидкости.
5. Эвтаназии животных от инфузии 3 мл 3 н KCl в хвостовую вену
6. Оценить стеки, используя опубликованы, публично доступный Matlab-компьютер на базе алгоритма, который будет создавать оттенки серого скорость потока и цвет кодируется карты для всех кровотока следы ^10,11. Впоследствии оценить полученные изображения в градациях серого с помощью коммерческого или публично доступное программное обеспечение для анализа изображений, таких как изображения J, после пороговой от значений, которые указывают на отсутствие движения клеток крови, т.е. не активное сосудов.

Результаты

Сосудистую в солидных опухолей, как известно, значительно отличаются от нормального кровоснабжения, показывающий большую степень извитости, и более высокие intervascular расстояния ^13. Соответственно, дорожки кровотока в экспериментальных легочных рака молочной железы и саркомы мета?...

Обсуждение

Модель представлена, что является возможным изменениям изображения в микроциркуляторном кровотока и других динамических процессов в легких метастазов у ​​крыс, используя прижизненный микроскопии и вычислительный анализ потока крови. В то время как другие методы существуют, чтобы в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope