אוטומטי מדידה של microcirculatory זרימת דם ריאתי במהירות גרורות של חולדות

Summary

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Abstract

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Introduction

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protocol

הערה: כל הנהלים הקשורים בבעלי החיים שתוארו בפרוטוקול זה אושרו בעבר על ידי ועדת אוניברסיטת דיוק מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (DUIACUC).

תרבית תאי 1. סרטן והזרקה

1. לטפח תאי סרטן גרורתי שכותרתו fluorescently (למשל תאי סרטן שד MDAMB231-GFP אנושיים, מתנת מד"ר פטרישיה Steeg, NCI, ותאי סרקומה עכבר כותרת YFP, מתנה מד"ר דוד קירש, המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק, המחלקה לקרינת אונקולוגיה) במדיום המתאים תרבות (הנשר בינוני השתנה למשל של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי ו -1% פניצילין / streptavidin) על 37 מעלות צלזיוס עד מחוברות כ -90%.
2. Trypsinize תאים, לשטוף אותם 2 פעמים עם PBS, לספור, ואז מזריק אותם לורידי הזנב של חולדות מורדמת-isoflurane 10 שבועות ישנות עירום נשי ב5 מיליון תאים לכל בעלי חיים, באמצעות מזרק עם מחט 27 G. anesthes רמת כירורגיIA מאומת על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן.

2. ניטור של microCT שימוש גרורות

1. לבחון חולדות פעם בשבוע באמצעות מיקרו-CT / מיקרו-irradiator, כדי לזהות את הנוכחות של גרורות מעל כ 2 מ"מ קוטר בקוטר. מיקרו-CT הוא בהזמנה כפי שתואר קודם לכן ^12.
   1. חולדות בכפוף ל-3% הרדמה isoflurane לפני ההדמיה. לאשר הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן.
   2. לאחר תחילתה של הרדמה, להעביר במהירות חולדות לעריסת ההדמיה בחדר ההדמיה ולהתחבר דרך האף-קונוס לתערובת isoflurane-אוויר ב2.5-3%. להתאים את המיקום של החולדה בעריסה באופן שבית החזה שלה ממוקם בקרן הפוטונים של סורק microCT, באמצעות פקדי עמדה החיצוניים ומפריד לייזר על ערש ההדמיה. להבטיח את הדלת לחדר ההדמיה סגורה, כדי להגן על החוקר מקרן גמא.
   3. לשלוט על המיקום של החיה באמצעות שובמצלמת וידאו הצבעוני. לבצע ריצת בדיקת ההדמיה CT ברזולוציה נמוכה, ולהשתמש בתמונה וכתוצאה מכך להתאים את שדה הראייה לממדי xyz של חלל בית החזה.
   4. תמונת בית חזה העכברוש באמצעות מסנן אל 2 מ"מ ב 40 KVP, 2.5 mA, ו0.008 voxel בשעה 7 FPS ולהחזיר את בעלי החיים לכלוב שלה. הדמיה של בעל חיים אחד צריכה לקחת לא יותר מ -15 או 20 דקות. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
   5. לאשר גרורות ידי הופעתו של אובייקטים יחסית רדיו-אטום שלא יכול להיות מוסברת על ידי כלי דם intrathoracic (איור 1 א)

כירורגיה 3. חלון הלשכה

1. הרדמה, סימנים חיוניים וצנתור וריד הזנב
   1. בחר בעלי חיים עם נוכחות של מחלה גרורתית. הזרק חיה עם ד intraperitonealOSE של 50 מ"ג / קילוגרם pentobarbital. לאשר הרדמה ברמה כירורגית על ידי צביטת הבוהן לפני שתמשיך.
      הערה: פרוטוקולי הרדמה צריכים להיות מתאימים להגדרת ניסוי בהתאמה. Pentobarbital נבחר כאן כחומר הרדמה ארוך פועל, על מנת לגרום להרדמה עמוקה לנהלים ארוכים, תוך שהיא מציעה את האפשרות מחדש מינון קליל. עם זאת, הפסד של בעלי חיים למינון יתר היא בעיה נפוצה בהרדמה pentobarbital. אפשרות נוספת ששומרת על רפלקסים אוטונומיים במידה גדולה יותר מאשר pentobarbital היא קטמין בשילוב עם תרופות הרגעה כגון xylazine או medetomidine, אשר עם זאת מתירה רק למחזור המינון מחדש אחת.
   2. לגלח בעלי חיים בצד של הגוף שיש לו את המחלה גרורתית, ובאזור הצוואר, באמצעות קליפר. נגב את כל השיער הפזור שנותר מהעור. לאחר שיער רופף הוסר, תחול משחה וטרינרים לעיניים, כדי למנוע מהם מהתייבשות.
      הערה: ייתכן שיש לי חולדות בעירום athymic שיער שיורית שrequiהסרת מיל לפני שתמשיך עם פרוצדורות כירורגיות. חשוב מאוד להסיר את כל השיער ביסודיות, כפי שהוא עלול להפריע לנהלים והדמיה כירורגית.
   3. תקן את החיה במצב שכיבה על לוחית מתכת שמונחת על כרית חימום שהופץ מים 37 מעלות צלזיוס. הגפיים הקדמיים ואחוריים קבועים על הצלחת עם קלטת.
      הערה: כדאי לשלוט ולהקליט סימנים חיוניים, כגון קצב לב וחמצון דם עורקים באמצעות oximeter דופק, בכל הליכים כירורגיים וניסיוניים.
2. אינטובציה לקנה הנשימה
   1. על מנת למקם קטטר לאוורור של בעלי החיים, ראשון לעשות חתך רוחבי בצוואר הרחם עור, ואחריו את ההפרדה החציוני של הגחון שרירי האורך לקנה הנשימה.
   2. שימוש חוזר פעולת פתיחה לסגירה עם מלקחיים חדים ליצור מעבר לתפר באמצעות צד הגב של קנה הנשימה.
   3. לעשות חתך קטן לתוך קנה הנשימה על tצד שהוא הגחון, לא יותר מחצי עגול, כ בין הטבעת לקנה הנשימה השנייה ושלישית. השאר חלק של קנה הנשימה החשוף על פני השטח הגב ארוך מספיק, כדי לאפשר קיבוע של הצנתר לקנה הנשימה.
   4. הכנס 2.5-3.0 מ"מ "Y" צינורית לקנה הנשימה לתוך קנה הנשימה, ולהדק עם תפר 4-0 monofilament. להבטיח את הצינורית מחוברת למכונת נשמה באופני לחץ עם בקבוק מחובר לצינור התפוגה כי הוא מלא עם 6 סנטימטר של מים, כדי לשמור על לחץ ריאתי חיובי. גז Inflowing צריך להיות 100% חמצן, אלא אם כן רצוי בניסוי אחר.
   5. הכנס קטטר עם מחט G 25-27, ומלא מלוח heparinized לאחד מורידי הזנב של החולדה, ולתקן במקום עם קלטת.
      הערה: ודא patency של הקטטר וריד זנב לאורך כל ההליך על ידי הזרקת כמות קטנה של מלח heparinized שוב ושוב לוריד הזנב. כמו כן, אינטובציה oro-קנה הנשימה, כלומר הדרכתו של קנה הנשימהצינור דרך הפה של החיה המורדמת ועבר הגרון לתוך קנה הנשימה, הוא אלטרנטיבה אפשרית להליך tracheotomy שמתואר כאן. עם זאת, שיטה זו דורשת הכשרה וניסיון מיוחדים, כדי למנוע נזק לקנה הנשימה, וגם כדי למנוע את cannulation המקרי של הוושט.
3. יישום של חלון ריאתי
   1. הסר את העור מהצד של החזה שבו המחלה גרורתית ממוקמת, על ידי יצירת חתך, ולאחר מכן ניתוק העור באמצעות לנתיחה בוטה.
      הערה: העור ניתן נכרת והוסר לאחר ההתרחקות
   2. המשך על ידי לנתח שתי שכבות של שרירים שכיסה (pectoralis, serratus, וdorsi latissimus), אבל משאיר את השרירים הבין- ללא פגע. צור ניקוב בחלל החזה של כ 1.5 סנטימטרים קוטר, על ידי הסרת חלקים מבדרך כלל שתי צלעות סמוכות. באופן אידיאלי, לאתר את הניקוב באזור של r שישית והשביעיתסמונת המעי הרגיז.
   3. Osteotomy:
      1. כדי למזער את הדימום ונזק למשטח הריאות, בחוזקה להחזיק את הצלעות ללחתוך עם מלקחיים כירורגיים שיניים במהלך חיתוך. בעזרת מספריים כירורגיות, לחתוך בצד המדיאלי של הצלע ראשונה, בזווית של 45 מעלות כ, עוזב את הצד המחודד של עצם הצלע שנותר מחוץ מצביע.
      2. בהמשך לכך, לחתוך בצד הלטרלי של עצם הצלע באופן דומה, שוב עוזב את הצד המחודד של עצם הצלע מצביע כלפי חוץ, כדי למנוע נזק למשטח הריאות.
      3. חזור על התהליך עבור הצלעות הסמוכות, ואז לחתוך את שרירי הצלע ולהסיר את החתיכה נכרתה. במהלך הליך זה, לשמור על לחץ ריאה באופן שאינטראקציה מכאנית בין משטח הריאות וכלוב הצלעות ממוזערת. עושה זאת על ידי כראוי ויסות לחץ השראה במכונת ההנשמה.
   4. החדרה של החלון:
      1. הכנס חלון ריאות בהתאמה אישית, בהיקף של coverglass שהואמחובר לשקע פרספקס (איור 1). צרף את החלון לשקע ידי הדבקה, או על ידי מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום. הכנס את החלון באופן שגרורות משטח נמצאות קרוב למרכז של החלון. במידת צורך, להתאים את החור הוכנס להביא micrometastasis למרכז החלון על ידי להגדיל את החור מעט לצד, בהתאמה.
         הערה: מחלה גרורתית על פני השטח pleural יכולה להיות מזוהה כנקודות מזוהות בבירור לבנה או אזורים בתוך החלקים אחרים הוורודים לסלמון בצבע הבריא של פני השטח ריאות המופיעים בעיקר לאורך הסדקים. בעוד micrometastases יכול להתרחש באזורים אחרים של חיצוני pleural, שורות תאים נחקרו כמעט תמיד להציג חיפוי micrometastases באזור המחורר, פעם מחלה גרורתית יכולה להתגלות radiologically.
      2. לאחר הכנסת השקע לניקוב, ויצירת קשר ישיר עם אדר הקרביים של lung, תפר את הקצוות של מסגרת החלון לשריר הצלע שמסביב, באמצעות תפר 4.0 monofilament (איור 1 ג). השתמש בעלייה קלה של לחץ השראה במכונת ההנשמה כדי לעזור אוויר שייר לברוח וליצור חותם.
         הערה: קצב הנשימה של חולדות יכול להשתנות במידה רבה, בהתאם למצב של הרדמה, מצב של התרגשות או חרדה, ריכוז חמצן באוויר השראה (FiO _2), וכו 'זה recommendable כדי להתאים את קצב הנשימה בין 70 ל -90 פעימות לדקה. לחץ ההשראה צריך להיות מותאם בזהירות ולא להיות מוגדר יותר מ כ. 8 סנטימטרים H ₂ O (0.6 מ"מ כספית), כדי למנוע נזק למשטח הריאות.
   5. מקם את החיה בעוצר נועד מותאם אישית שנועד לחסל את תנועת Z-כיוונית (1D איור) על צלחת פלדה שממוקמת על שמיכת חימום תרמוסטטי (חשמל), תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשלוט בגופו של בעל החייםטמפרטורה באמצעות thermistor רקטלית. התאם את הברגים של עוצר בעלי החיים, ולחץ ההשראה במכונת ההנשמה להשיג שליטה אופטימלית של תנועה לרוחב.
      הערה: נשימה טבעית ביונקים כוללת את כל שלושת כיוונים של תנועת ריאות והארכת חזה: וקרניו-הזנב בין שתי המדינות, dorso- גחון,. על מנת לשמר את תנועת הנשימה הטבעית ככל האפשר, חשוב למזער דחיסת Z-כיוונית במידת הצורך. בגלל האיפוק Z-ממדי יש הפוטנציאל להציג חפצים שעשויים להשפיע על זרימת דם ופרמטרים נוספים, רצוי לשמור על תנאים קבועים בסדרה של מדידות חוזרות ונשנות באותה החיה.

4. הדמיה ומדידה של זרימת דם microcirculatory

1. איסוף תאי דם אדומים באמצעות לנקב לב ולתייג אותם עם DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 פרכלורט =, 3 = -tetramethyl-indocarbocyanine), כפי שתואר לעיל ^10.
2. להזריק 300 μl של תאי דם אדומים שכותרתו לוריד הזנב של העכברוש לפני ניתוח חלון התא נעשה, כדי למנוע תופעות הידבקות הראשונות לעבור לחלון הזכוכית. לחסל את כל בועות אוויר במזרק או צנתר, כמבוא של אוויר לתוך הווריד ימנע כל זריקות נוספות.
3. זרימת דם תמונה עם מצלמת CCD מיקרוסקופ בשבב -40 ° C קירור טמפרטורה, וכ 100X רזולוציה כוללת (כלומר עם מטרת מיקרוסקופ 10X, 10X ועיני לפני מצלמה). השתמש במערכות סינון Rhodamine / TRITC סטנדרטיים (ננומטר 450-490 עירור, פליטה> 515 ננומטר). רשום את הרזולוציה מסגרת הדולר ופיקסל בפועל של רצפי תמונה המתקבלות. שיא לפחות 200 (רצוי סביב 300) תמונות לערימה, כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות זרימה.
4. לחדש אובדן נוזלים בבעלי החיים על ידי הזרקה כ 1 מיליליטר של ip מלוח כל שעה.
   הערה: הגדרות ניסויית שכרוכות בהתערבות, למשלתרופה שמשנה את מהירות זרימת דם בגרורות סרטן ריאה, דורשת מדידות חוזרות ונשנות של זרימת דם במהירות הסרטן גרורתי ריאתי. בניסויים מורחבים אלה, חשוב לחדש את החיה עם נוזל מספיק.
5. להרדים בעלי החיים על ידי עירוי של 3 מיליליטר של 3N KCl לתוך וריד הזנב
6. להעריך את ערימות תמונה באמצעות אלגוריתם שפורסם, זמין בפומבי מבוסס Matlab מחשב שייצור בגווני אפור מהירות זרימה ומפות בצבע המקודדת לכל זרימת הדם עוקב ^10,11. בהמשך לכך להעריך את התמונות בגווני אפור וכתוצאה מכך על ידי שימוש בתוכנת ניתוח תמונה מסחרית או זמינה לציבור, כגון התמונה J, לאחר thresholding את ערכים המצביעים על שום תנועה של תאי דם, כלומר אין כלי דם פעילים.

תוצאות

כלי הדם בגידולים מוצקים ידוע שונה באופן משמעותי מאספקת דם נורמלית, מראים דרגות גבוהות יותר של tortuosity, ומרחקי intervascular גבוהים יותר ^13. בהתאם לכך, יש לי זרימת דם במסלולי גרורות סרטן השד וסרקומה ריאה ניסיונית צורות חריגות ופערים intervascular גדולים (איור 2 א, שני לו...

Discussion

מודל מוצג שאינו ריאלי לשינויים בזרימת דם תמונת microcirculatory ותהליכים דינמיים אחרים בגרורות ריאות של חולדות, באמצעות מיקרוסקופ intravital וזרימת דם אנליזה חישובית. בעוד שיטות אחרות קיימות כדי לבצע מיקרוסקופיה על ריאות שנחשפו בבית החזה פתוח של מכרסמים, מודל זה הוא גם ראשון שג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope