Automated Medição da microcirculação sanguínea velocidade na Pulmonar Metástases of Rats

Resumo

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Resumo

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Introdução

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos relacionados animais descritos neste protocolo ter sido previamente aprovado pela Institutional Animal Care e Use Comitê da Universidade Duke (DUIACUC).

1. Cancer Cultura de Células e Injeção

1. Cultivar células cancerígenas metastáticas marcados com fluorescência (por exemplo, células de câncer de mama MDAMB231-GFP humanos, dom de Dr. Patricia Steeg, NCI, e células de sarcoma rato YFP marcadas, presente do Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Department of Radiation Oncology) em meio de cultura apropriado (por exemplo, de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptavidina) a 37 ° C até cerca de 90% confluente.
2. Tripsinizar células, lave-as duas vezes com PBS, contar e depois injetá-las na veia da cauda de 10 semanas de idade ratos nus femininos anestesiados com isoflurano em 5 milhões de células por animal, usando uma seringa com uma agulha 27 G. Anesthes Cirúrgico nívelIA é verificado pela falta de reação aos pés pinch.

2. O controlo das metástases com MicroCT

1. Examinar ratos uma vez por semana utilizando um micro-CT / micro-irradiador, para detectar a presença de metástases acima de aproximadamente 2 mm de diâmetro de diâmetro. O micro-CT é comissionado, como descrito anteriormente ^12.
   1. Ratos sujeitos a 3% de isoflurano anestesia antes da imagem. Confirme anestesia profunda por toe pitada.
   2. Após o início da anestesia, rápida transferência de ratos para o berço de imagem na câmara de imagem e se conectar através de um nariz-cone a uma mistura de isoflurano ao ar em 2,5-3%. Ajustar a posição do rato no suporte de uma maneira que a sua tórax é colocado no feixe de fotões do scanner MicroCT, utilizando os controlos de posição externos e delimitador do laser na base de imagens. Assegurar a porta para a câmara de imagem está fechada, para proteger o investigador dos raios gama.
   3. Controlar a posição do animal usando novamentea câmera de vídeo a cores. Realize uma baixa resolução exame de imagem CT prazo, e usar a imagem resultante para ajustar o campo de visão para as dimensões xyz da cavidade torácica.
   4. Imagem do tórax rato usando um filtro de 2 milímetros Al a 40 kVp, 2,5 mA, e 0,008 voxel às 7 FPS e devolver o animal para sua gaiola. Imagem de um animal deve ter não mais do que 15 ou 20 min. Não devolva um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
   5. Confirmar metástases pela aparência de objectos relativamente radio-opaco, que não pode ser explicado por vasos sanguíneos intratorácicas (Figura 1A)

Cirurgia 3. Window Câmara

1. Anestesia, sinais vitais e de uma veia da cauda
   1. Escolha animais com presença de doença metastática. Injectar animal com um d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia de nível cirúrgico por toe pitada antes de prosseguir.
      Nota: Os protocolos de anestesia deve ser compensada com a respectiva configuração experimental. Pentobarbital foi escolhido aqui como um anestésico de ação longa, a fim de induzir a anestesia profunda para procedimentos demorados, além de oferecer a opção de re-dosagem fácil. No entanto, a perda de animais sobredosagem é um problema comum com anestesia de pentobarbital. Uma outra opção que preserva reflexos autonômicos a um grau maior do que o pentobarbital é cetamina, em combinação com o uso de sedativos como xilazina ou medetomidina, que no entanto só permite para um único ciclo de re-dosagem.
   2. Raspar animais no lado do corpo que tem a doença metastática, e na área do pescoço, utilizando uma máquina de cortar. Limpe todos os restantes cabelo solto da pele. Depois de cabelo solto é removido, aplique pomada veterinária para os olhos, para evitar que sequem.
      NOTA: ratos pelados atímicos pode ter cabelo residual que seja necessária aremoção res antes de prosseguir com os procedimentos cirúrgicos. É muito importante para remover todo o cabelo completamente, pois pode interferir com os procedimentos cirúrgicos e de imagem.
   3. Corrigir o animal numa posição supina sobre uma placa metálica que é colocado sobre uma almofada de aquecimento de 37 ° C a água circula. As extremidades dianteiras e traseiras são fixados na placa com fita.
      NOTA: É útil para controlar e registrar os sinais vitais, como batimentos cardíacos e oxigenação do sangue arterial, utilizando um oxímetro de pulso, ao longo de procedimentos cirúrgicos e experimentais.
2. A intubação traqueal
   1. A fim de colocar um cateter para a ventilação do animal, em primeiro lugar fazer uma incisão cutânea transversal do colo do útero, seguido pela separação mediana ventral da musculatura longitudinal para a traqueia.
   2. Use repetida acção de abertura-a-fecho com uma pinça afiada para criar uma passagem para o fio de sutura através do lado dorsal da traqueia.
   3. Fazer uma pequena incisão na traqueia em tele lado ventral, não mais do que semi-circular, aproximadamente entre o segundo e terceiro anel traqueal. Deixar um tempo suficientemente longo de parte da traqueia exposta na superfície dorsal, para permitir a fixação do cateter traqueal.
   4. Insira um 2,5 a 3,0 mm "Y" cânula traqueal na traquéia, e aperte com uma sutura de monofilamento 4-0. Assegurar a cânula está ligada a um ventilador de pressão cíclica, com uma garrafa ligada à conduta de validade que é preenchido com 6 cm de água, para manter a pressão pulmonar positiva. Fluxo de entrada de gás deve ser 100% de oxigénio, a menos que de outra forma desejada experimentalmente.
   5. Inserir um cateter com uma agulha G 25-27, e preenchido com solução salina heparinizada em uma das veias da cauda do rato, e fixar com fita adesiva.
      Nota: certifique-patência do cateter na veia da cauda durante todo o procedimento por injecções sucessivas de uma pequena quantidade de soro fisiológico heparinizado na veia da cauda. Além disso, a intubação oro-traqueal, ou seja, a orientação de um traquealtubo através da boca do animal anestesiado e passado a laringe e a traqueia, é uma alternativa possível para o procedimento de traqueostomia que é descrito aqui. No entanto, este método requer treino e experiência especial, a fim de evitar danos para a traqueia, e também para impedir a canulação acidental do esófago.
3. Aplicação da janela pulmonar
   1. Remover a pele do lado da caixa, onde a doença metastática é localizado, através da criação de uma incisão, e em seguida, retirar a pele utilizando uma dissecção romba.
      Nota: A pele pode ser excisado e removido subsequente ao descolamento
   2. Prossiga dissecando as duas camadas de musculatura sobrepondo (peitoral, serratus, e grande dorsal), mas deixando os músculos intercostais intacta. Criar uma perfuração na cavidade torácica de aproximadamente 1,5 cm de diâmetro, através da remoção de porções de tipicamente duas nervuras adjacentes. Idealmente, localize a perfuração da região do sexto e sétimo rIBS.
   3. Osteotomia:
      1. Para minimizar o sangramento e danos à superfície do pulmão, firmemente segurar a costela para ser cortado com uma pinça cirúrgica de dentes durante o corte. Utilizando uma tesoura cirúrgica, cortar o lado medial da primeira nervura, a um ângulo de aproximadamente 45 °, deixando o lado aguçado do osso remanescente nervura que aponta fora.
      2. Posteriormente, o corte lateral do osso do reforço de uma forma semelhante, de novo deixando o lado aguçado do osso nervura que aponta para o exterior, para evitar danos na superfície do pulmão.
      3. Repita o procedimento para a costela ao lado, em seguida, corte os músculos intercostais e remover a parte extirpada. Durante este procedimento, a manter a pressão pulmonar de forma que a interacção mecânica entre a superfície do pulmão e da caixa torácica é minimizado. Faça isso de forma adequada regulação da pressão inspiração no ventilador.
   4. Inserção da janela:
      1. Insira uma janela de pulmão feito à medida, que consiste em uma lamela que éligado a uma tomada de Plexiglas (Figura 1B). Anexar a janela para a tomada por meio de colagem, ou através da aplicação de uma quantidade muito pequena de gordura vácuo. Inserir a janela de uma forma que as metástases de superfície estão localizados perto do centro da janela. Se necessário, ajustar o furo inserido para trazer o micrometástases para o centro da janela através do alargamento do furo ligeiramente para o lado respectivo.
         NOTA: A doença metastática na superfície pleural podem ser identificados como pontos brancos claramente reconhecíveis ou as zonas das partes coloridas de outra forma saudáveis ​​rosa-salmão de superfície para o pulmão que aparecem predominantemente ao longo das fissuras. Enquanto micrometástases pode ocorrer em outras áreas do exterior pleural, as linhas de células investigadas quase sempre exibir tona micrometástases na área perfurada, uma vez que a doença metastática pode ser detectado radiologicamente.
      2. Depois de inserir o soquete para a perfuração e criação de contato direto com a pleura visceral do lung, suturar as extremidades da moldura da janela para o músculo intercostal circundante, usando sutura de monofilamento 4.0 (Figura 1C). Use um ligeiro aumento de pressão inspiração no ventilador para ajudar ar residual para escapar e para criar um selo.
         Nota: A taxa de respiração de ratos pode variar muito, dependendo do estado de anestesia, o estado de excitação ou ansiedade, concentração de oxigênio do ar inspirado (FiO _2), etc. É recomendável ajustar a taxa de respiração entre 70 e 90 bpm. A pressão de inspiração deve ser ajustada com cuidado e não ser ajustado para mais de aprox. 8 centímetros _H2O (0,6 mmHg), a fim de evitar danos à superfície do pulmão.
   5. Posicione o animal em um limitador projetada que é projetado para eliminar Z-direcional movimento (Figura 1D) em uma placa de aço que está posicionado em uma termostática (elétrica) cobertor de aquecimento, sob um microscópio de fluorescência. Controlar o corpo do animaltemperatura utilizando um termistor rectal. Ajuste os parafusos do restrainer animal, ea pressão inspiração no ventilador para conseguir o controle ideal de movimento lateral.
      Nota: A respiração natural em mamíferos envolve todos os três sentidos de circulação pulmonar e extensão peito: bilateral, dorso-ventral, e crânio-caudal. A fim de preservar o movimento de respiração natural, tanto quanto possível, é importante minimizar Z-direcional compressão na medida do necessário. Porque o sistema de retenção Z-dimensional tem o potencial para introduzir artefactos que possam afectar o fluxo de sangue e de outros parâmetros, é aconselhável manter as condições constantes durante série de medições repetidas no mesmo animal.

4. Imaging and Measurement de Microcirculatory fluxo de sangue

1. Coletar as células vermelhas do sangue através de punção cardíaca e rotulá-los com DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = perclorato, 3 = -tetrametil-indocarbocianina), como descrito anteriormente ^10.
2. Injectar 300 ul de hemácias marcadas na veia da cauda do rato antes da cirurgia câmara de janela é feito para evitar o efeito de primeira passagem de adesão para a janela de vidro. Eliminar quaisquer bolhas de ar na seringa ou cateter, como a introdução de ar na veia irá inibir quaisquer outras injecções.
3. Fluxo sanguíneo imagem com uma câmara CCD microscópio a -40 ° C chip de temperatura de arrefecimento, e aproximadamente 100X resolução geral (isto é, com uma objectiva de microscópio de 10x, 10x e pré-câmara ocular). Use padrão de filtro Rhodamine / TRITC sets (excitação 450-490 nm, emissão> 515 nm). Grave a resolução e taxa de quadros real de pixel as sequências de imagens resultantes. Grave, pelo menos, 200 (idealmente em torno de 300) imagens por pilha, para garantir a análise de sucesso da velocidade do fluxo.
4. Reabastecer a perda de líquidos no animal através da injeção de aproximadamente 1 ml de solução salina IP cada hr.
   NOTA: As configurações experimentais que envolvem uma intervenção, por exemplo,uma droga que altera a velocidade do fluxo sanguíneo em uma metástase do câncer pulmonar, exige medições repetidas de velocidade do fluxo sanguíneo em câncer metastático pulmonar. Para estas experiências prolongadas, é importante para repor o animal com fluido suficiente.
5. Eutanásia dos animais por infusão de 3 ml de 3N de KCl na veia da cauda
6. Avaliar as pilhas de imagens usando um publicado, algoritmo de computador publicamente disponível baseado em Matlab que vai criar o fluxo de velocidade em tons de cinza e mapas de cor codificado para todo o fluxo de sangue traça ^10,11. Posteriormente avaliar as imagens em tons de cinza resultantes usando software de análise de imagem comercial ou acessível ao público, tais como Imagem J, após limiarizar off valores que indicam nenhum movimento de células do sangue, ou seja, sem vasculatura ativa.

Resultados

A vasculatura em tumores sólidos é conhecido por diferir significativamente de suprimento de sangue normal, mostrando maiores graus de tortuosidade e maiores distâncias intervasculares ^13. Por conseguinte, as faixas de fluxo de sangue em metástases de cancro da mama e do sarcoma pulmonares experimentais têm formas irregulares e grandes lacunas intervasculares (Figura 2A, dois painéis inferiores) em comparação com a microcirculação pulmonar normal (Figura 2A, painel ...

Discussão

Um modelo é apresentado que é viável a imagem muda em microcirculação outros processos dinâmicos em metástases pulmonares de ratos, o fluxo de sangue e, através de microscopia intravital e análise de fluxo sangüíneo computacional. Embora existam outros métodos para efectuar microscopia em pulmões expostos em caixas torácicas abertas de roedores, este modelo também é o primeiro a metástases pulmonares de imagem através de uma perfuração da parede torácica, num ambiente de tórax fechado. Usando este ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope