Mesure automatisée du flux sanguin Microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats

Résumé

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Résumé

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Introduction

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures liées aux animaux décrits dans le présent protocole ont été préalablement approuvé par le soin et l'utilisation institutionnelle animaux Comité Duke University (DUIACUC).

1. Culture cellulaire et cancer Injection

1. Cultiver des cellules cancéreuses métastatiques marquées par fluorescence (par exemple des cellules de cancer du sein MDAMB231-GFP humaines, don du Dr. Patricia Steeg, NCI, et les cellules de sarcome de la souris YFP-étiquetés, don du Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Département de radio-oncologie) dans un milieu de culture approprié (milieu de Eagle modifié par exemple par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptavidine) à 37 ° C jusqu'à environ 90% de confluence.
2. Trypsiniser cellules, les laver deux fois avec du PBS, compter, et ensuite les injecter dans les veines de la queue de 10 semaines vieux rats nus féminins de l'isoflurane anesthésiés à 5 millions de cellules par animal, en utilisant une seringue avec une aiguille 27 G. Anesthes niveau chirurgicalesia est vérifiée par l'absence de réaction de pincement de l'orteil.

2. Suivi des métastases Utilisation microCT

1. Examiner les rats une fois par semaine en utilisant un micro-CT / micro-irradiateur, pour détecter la présence de métastases au-dessus d'environ 2 mm de diamètre de diamètre. Le micro-CT est commandé comme décrit précédemment ^12.
   1. Rats soumis à 3% d'isoflurane anesthésie préalable à l'imagerie. Confirmez anesthésie profonde par pincement de l'orteil.
   2. Après le début de l'anesthésie, transférer rapidement des rats au berceau de l'imagerie dans la chambre de l'imagerie et de se connecter via un nez cône à un mélange isoflurane-air à 2,5-3%. Ajuster la position du rat dans le berceau de façon que son thorax est positionné dans le faisceau de photons de la microCT scanner, en utilisant les commandes de position externes et délimiteur de laser sur le support de formation d'image. Se assurer que la porte de la chambre d'imagerie est fermé, pour protéger l'enquêteur des rayons gamma.
   3. Contrôler la position de l'animal en utilisant à nouveaula caméra vidéo couleur. Effectuez une basse résolution test d'imagerie CT terme, et d'utiliser l'image résultante pour régler le champ de vision aux dimensions xyz de la cavité thoracique.
   4. Image du thorax de rat en utilisant un filtre 2 mm Al à 40 kV, 2,5 mA, et 0,008 voxel au 7 FPS et le réexpédier vers sa cage. Imagerie d'un animal devrait prendre pas plus de 15 ou 20 min. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
   5. Confirmez métastases par l'apparition d'objets relativement radio-opaque qui ne peut être expliqué par des vaisseaux sanguins intrathoraciques (figure 1A)

Chirurgie 3. Chambre Fenêtre

1. Anesthésie, les signes vitaux et veine de la queue cathétérisme
   1. Sélectionnez animaux avec la présence de la maladie métastatique. Injecter animal avec un d intrapéritonéaleose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirmez niveau anesthésie chirurgicale par pincement de l'orteil avant de procéder.
      Note: protocoles d'anesthésie doivent être adaptées à la configuration expérimentale respective. Pentobarbital a été choisi ici comme un anesthésique à action prolongée, afin d'induire anesthésie profonde pendant de longues procédures, tout en offrant la possibilité de re-dosage facile. Toutefois, la perte d'animaux à un surdosage est un problème commun avec anesthésie au pentobarbital. Une autre option qui préserve réflexes autonomes à un degré plus grand que le pentobarbital est la kétamine en combinaison avec des sédatifs tels que la xylazine ou médétomidine, qui permet cependant uniquement pour un cycle de ré-dosage unique.
   2. Raser les animaux sur le côté du corps qui a la maladie métastatique, et dans la région du cou en utilisant une tondeuse. Essuyer tout en restant cheveux dénoués de la peau. Après les cheveux dénoués est retirée, appliquer une pommade vétérinaire pour les yeux, pour les empêcher de se dessécher.
      REMARQUE: rats nus athymiques peuvent avoir les cheveux résiduel qui requiélimination res avant de procéder à des interventions chirurgicales. Il est très important d'enlever tous les cheveux soigneusement, car il peut interférer avec les procédures chirurgicales et d'imagerie.
   3. Fixer l'animal dans une position couchée sur une plaque métallique qui est placé sur un coussin chauffant l'eau C 37 ° distribué. Les extrémités avant et arrière sont fixés sur la plaque avec du ruban adhésif.
      NOTE: Il est utile de contrôler et d'enregistrer les signes vitaux, tels que la fréquence cardiaque et l'oxygénation artérielle du sang en utilisant un oxymètre de pouls, tout au long des procédures chirurgicales et expérimentales.
2. Intubation trachéale
   1. Afin de placer un cathéter pour la ventilation de l'animal, d'abord faire une incision transversale du col de la peau, suivie de la séparation médiane ventrale de la musculature longitudinale de la trachée.
   2. L'utilisation répétée des mesures ouverture à la fermeture avec une forte pince pour créer un passage pour le fil de suture à travers la face dorsale de la trachée.
   3. Faire une petite incision dans la trachée sur til face ventrale, pas plus que semi-circulaire, approximativement entre le deuxième et le troisième anneau trachéal. Laisser un temps suffisamment long portion de la trachée exposée sur la face dorsale, afin de permettre la fixation de la sonde trachéale.
   4. Insérez un mm "Y" canule trachéale de 2,5 à 3,0 dans la trachée, et serrer avec une suture 4-0 monofilament. Se assurer que la canule est reliée à un ventilateur de pression cyclée avec une bouteille reliée au conduit d'expiration qui est rempli de 6 cm d'eau, pour maintenir la pression pulmonaire positive. Flot de gaz devrait être de 100% d'oxygène, à moins expérimentalement souhaité autrement.
   5. Insérer un cathéter avec une aiguille de 25 à 27 G, et rempli de solution saline héparinée dans l'une des veines de la queue du rat, et fixer en place avec du ruban adhésif.
      REMARQUE: Veiller à la perméabilité du cathéter veine de la queue toute la procédure en injectant plusieurs reprises une petite quantité de sérum physiologique hépariné dans la veine de la queue. En outre, l'intubation oro-trachéale, ce est à dire la direction d'un trachéaletube par la bouche de l'animal anesthésié et au-delà du larynx dans la trachée, est une alternative possible à la procédure de trachéotomie qui est décrit ici. Cependant, cette méthode nécessite une formation spéciale et de l'expérience, pour éviter d'endommager la trachée, et aussi pour empêcher l'cathétérisme accidentelle de l'œsophage.
3. Application de la fenêtre pulmonaire
   1. Retirer la peau du côté de la poitrine où se trouve la maladie métastatique, en créant une incision, puis détacher la peau en utilisant une dissection mousse.
      Remarque: La peau peut être excisé et retiré après détachement
   2. Passez en disséquant les deux couches de muscles recouvrant (pectoral, dentelé et grand dorsal), mais en laissant les muscles intercostaux intacte. Créer une perforation dans la cavité thoracique d'environ 1,5 cm de diamètre, en enlevant des parties de typiquement deux nervures adjacentes. Idéalement, localiser la perforation dans la région de la sixième et de la septième ribs.
   3. Ostéotomie:
      1. Pour minimiser les saignements et les dommages à la surface du poumon, tenir fermement la nervure à couper avec une pince chirurgicale dentées pendant la coupe. Avec des ciseaux chirurgicaux, couper la partie médiane de la première nervure, à un angle d'environ 45 °, laissant le côté pointu de l'os de côte reste pointant extérieur.
      2. Par la suite, couper la face latérale de l'os de la nervure d'une manière similaire, en laissant à nouveau la partie pointue de l'os de la nervure dirigée vers l'extérieur, pour éviter d'endommager la surface du poumon.
      3. Répétez la procédure pour la nervure adjacente, puis couper les muscles intercostaux et retirer la pièce excisée. Pendant cette procédure, maintenir la pression de poumon de façon que l'interaction mécanique entre la surface du poumon et la cage thoracique est minimisée. Pour ce faire, en régulant la pression appropriée de l'inspiration sur le ventilateur.
   4. Insertion de la fenêtre:
      1. Insérer une fenêtre de poumon sur mesure, composé d'une lamelle qui estrelié à une prise en plexiglas (figure 1B). Fixer la fenêtre à la douille par collage, ou par l'application d'une très petite quantité de graisse à vide. Insérez la fenêtre de façon que les métastases de surface sont situés à proximité du centre de la fenêtre. Si nécessaire, ajuster le trou inséré pour amener le micrométastases au centre de la fenêtre en agrandissant légèrement le trou sur le côté respectif.
         REMARQUE: maladie métastatique sur la surface pleurale peut être identifié en tant que points blancs clairement reconnaissables ou des zones à l'intérieur des parties autrement à rose saumon couleur saines de la surface du poumon qui apparaissent principalement le long des fissures. Bien micrométastases peuvent se produire sur d'autres secteurs de l'extérieur pleural, les lignées cellulaires étudiées présentent presque toujours surfaçage micrométastases dans la zone perforée, une fois que la maladie métastatique peut être radiologiquement détecté.
      2. Après l'insertion de la douille dans la perforation, et la création d'un contact direct avec la plèvre viscérale de la lUng, suturer les bords du cadre de la fenêtre au muscle intercostal environnant, en utilisant 4,0 suture monofilament (figure 1C). Utilisez une légère augmentation de la pression de l'inspiration sur le ventilateur pour aider air résiduel de se échapper et pour créer un joint.
         Note: Le taux de rats de la respiration peut varier considérablement, en fonction du statut de l'anesthésie, état ​​d'excitation ou d'anxiété, concentration en oxygène de l'air inspiré _(FiO2), etc. Il est recommandé de régler le taux de respiration entre 70 et 90 bpm. La pression de l'inspiration devrait être réglé avec prudence et ne pas être réglé à plus de env. 8 cm H ₂ O (0,6 mm de Hg), pour éviter d'endommager la surface du poumon.
   5. Placer l'animal dans un dispositif de retenue conçu sur mesure qui est conçu pour éliminer le mouvement dans la direction Z (figure 1D) sur une plaque d'acier qui est positionné sur une thermostatique (électricité) couverture chauffante, sous un microscope à fluorescence. Contrôler le corps de l'animalla température rectale à l'aide d'une thermistance. Ajuster les vis du dispositif de retenue d'animal, et la pression d'inspiration sur le ventilateur pour obtenir un contrôle optimal de mouvement latéral.
      Remarque: la respiration naturelle chez les mammifères implique tous les trois directions de mouvement du poumon et l'extension de la poitrine:, dorso-ventral et cranio-caudale bilatérale. Afin de préserver le mouvement de la respiration naturelle autant que possible, il est important de minimiser la compression dans la direction Z dans la mesure nécessaire. Parce que l'appuie-Z-dimensionnelle a le potentiel d'introduire des artefacts qui peuvent affecter la circulation sanguine et d'autres paramètres, il est conseillé de garder conditions constante pendant série de mesures répétées chez le même animal.

4. imagerie et mesure du débit sanguin Microcirculatory

1. Recueillir les globules rouges par ponction cardiaque et les étiqueter avec Dil (1,1-3,3,3 -dioctadecyl = = perchlorate, 3 =-tétraméthyl indocarbocyanine), comme décrit précédemment ^10.
2. Injecter 300 ul de globules rouges marqués dans la veine caudale du rat avant l'opération de la chambre de fenêtre est fait, pour éviter les effets première passe d'adhérence à la vitre en verre. Éliminer les bulles d'air dans la seringue ou un cathéter, que l'introduction de l'air dans la veine va inhiber d'autres injections.
3. Image du flux sanguin avec une caméra CCD de microscope à -40 ° C puce température de refroidissement, et d'environ 100X résolution globale (ce est à dire avec un objectif de microscope 10X, 10X et pré-caméra oculaire). Utilisez standards jeux de filtres rhodamine / TRITC (excitation 450-490 nm, émission> 515 nm). Enregistrer le taux de trame et pixel résolution réelle des séquences d'images qui en résultent. Marquer au moins 200 (idéalement environ 300) images par pile, afin d'assurer une analyse réussie de la vitesse d'écoulement.
4. Reconstituer la perte de fluide dans l'animal en injectant environ 1 ml de solution saline ip chaque h.
   REMARQUE: Les paramètres expérimentaux qui impliquent une intervention, par exempleun médicament qui modifie la vitesse d'écoulement du sang dans une métastase de cancer pulmonaire, nécessite des mesures répétées de la vitesse d'écoulement du sang dans le cancer métastatique pulmonaire. Pour ces expériences étendues, il est important de reconstituer l'animal avec suffisamment de liquide.
5. Euthanasier les animaux en perfusion de 3 ml de 3N KCl dans la veine de la queue
6. Évaluer les piles d'images en utilisant un, disponible publiquement algorithme publié ordinateur basé sur Matlab qui créera flux niveaux de gris de la vitesse et des cartes de couleur codé pour tous les flux de traces de sang ^10,11. Évaluer la suite les images en niveaux de gris résultant en utilisant un logiciel d'analyse d'image commerciale ou accessibles au public, tels que Image J, après un seuil hors des valeurs qui indiquent aucun mouvement de globules, ce est à dire pas de système vasculaire active.

Résultats

La vascularisation dans les tumeurs solides est connu pour différer considérablement de l'approvisionnement en sang normale, montrant de plus grands degrés de tortuosité et les distances intervasculaires plus élevés ^13. En conséquence, les pistes de la circulation sanguine dans le cancer du sein et de métastases pulmonaires sarcome expérimentales ont des formes irrégulières et de grandes lacunes intervasculaires (figure 2A, deux panneaux inférieurs) par rapport à la microcirc...

Discussion

On présente un modèle qui est possible à l'évolution de l'image dans le débit sanguin microcirculatoire et d'autres processus dynamiques dans des métastases pulmonaires de rat, en utilisant la microscopie intravitale et l'analyse de la circulation sanguine calcul. Alors que d'autres méthodes existent pour effectuer la microscopie sur les poumons exposés en cages thoraciques ouvertes de rongeurs, ce modèle est également le premier à l'image des métastases pulmonaires par une perforatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope