쥐의 폐 전이의 미세 혈류 속도의 자동 측정

요약

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

초록

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

서문

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

프로토콜

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 관련 절차 이전에 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (DUIACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 암 세포 배양 및 사출

1. 형광 표지 된 전이성 암 세포를 배양 (예를 들어 인간의 MDAMB231-GFP 유방암 세포, 박사 패트리샤 STEEG, NCI 및 YFP 표지 마우스 육종 세포, 박사 데이빗 커쉬, 듀크 대학 의료 센터, 방사선 종양학 부서의 선물에서 선물) 적절한 배양 배지 (예 : 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙 트 아비딘 (DMEM)) 37 ° C에서 약 90 % 컨 플루 언트 될 때까지.
2. , 세포를 Trypsinize PBS로 2 회 반복한다, 계산 한 다음, 27 G 바늘과 주사기를 사용, 동물 당 5 백만 세포에서 이소 플루 란 - 마취 10 주 오래 된 여성 누드 쥐의 꼬리 정맥로를 주입. 수술 수준 anesthesIA는 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 확인됩니다.

전이 사용 MicroCT 2. 모니터링

1. 전이 직경 직경으로 약 2mm의 존재를 검출하기 위해, 마이크로 - CT / 마이크로 조사기를 사용하여 래트를 일주일에 한 번 검사. 이전 ¹² 설명한 바와 같이 마이크로 CT를 의뢰한다.
   1. 이미징 이전에 3 % 이소 플루 란 마취에 따라 쥐. 발가락 핀치에 의해 깊은 마취를 확인합니다.
   2. 마취 개시 후 신속 촬상 챔버 촬상 크래들 래트를 전송 및 2.5-3 %의 이소 플루 란 - 공기 혼합물에 노즈 콘 통해 연결. 영상 크래들에 외부 위치 제어 및 레이저 구분 기호를 사용하여, 그 가슴이 MicroCT 스캐너의 광자 빔에 위치하는 방식으로 크래들에 쥐의 위치를​​ 조정합니다. 감마선에서 조사를 보호하기 위해, 영상 실의 문이 닫혀 있는지 확인합니다.
   3. 다시 사용하여 동물의 위치를​​ 제어컬러 비디오 카메라. 저해상도 CT 이미징 테스트 실행을 수행하고 흉강의 XYZ 치수의 시야를 조정하기 위해 생성 된 화상을 사용한다.
   4. 이미지 쥐의 40 KVP에서 2mm 알루미늄 필터를 사용하여 흉부, 2.5 mA, 7 FPS에서 0.008 복셀과는 케이지에 동물을 반환합니다. 한 동물의 이미지를 잘 작성하지 최근 15 또는 20 분 소요됩니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
   5. 흉부 내 혈관에 의해 설명 될 수없는 무선 비교적 불투명 오브젝트의 외관을 확인하여 전이 (도 1a)

3. 윈도우 상공 회의소 수술

1. 마취, 활력 징후 및 꼬리 정맥 카테터
   1. 전이성 질환의 존재와 동물을 선택합니다. 복강 D와 동물을 주입50 ㎎ / ㎏ 펜 토바 비탈의 OSE. 진행하기 전에 발가락 핀치에 의한 수술 수준의 마취를 확인합니다.
      주 : 마취 프로토콜은 각각의 실험 장치와 일치해야합니다. 용이 한 재 투여 선택권을 제공하는 동안은 펜 토바 비탈, 긴 절차 깊은 마취를 유도하기 위하여, 긴 작용 마취제 여기 선택되었다. 그러나, 과다 복용에 동물의 손실은 펜 토바 비탈 마취 일반적인 문제입니다. 펜 토바 비탈보다 더 큰 정도의 자율 반사 신경을 보존 또 다른 옵션은 그러나 단 하나의 재 투여주기 허용 자일 라진 (xylazine) 또는 medetomidine, 같은 진정제와 함께 케타민입니다.
   2. 클리퍼를 사용하여, 전이성 질환이 있고, 목 영역에서 본체의 측면에 동물을 면도. 피부의 모든 남아있는 느슨한 머리를 닦아냅니다. 탈모 제거한 후 마르지 않도록, 눈 연고 수의학 적용.
      참고 : 무 흉선 누드 쥐 requi 잔류 머리를 가질 수있다수술 절차를 진행하기 전에 입술 제거. 이 수술 절차 및 이미징을 방해 할 수 있으므로 그것은 철저하게 모든 머리를 제거하는 것이 매우 중요합니다.
   3. 37 ° C의 물 순환 가열 패드에 배치되는 금속 접시에 앙와위에서 동물을 고정합니다. 앞과 뒤의 사지 테이프와 함께 접시에 고정되어 있습니다.
      주 : 제어 및 수술 및 실험 절차 전반에 걸쳐, 맥박 산소 측정기를 사용하여 심장 요금과 동맥혈 산소와 같은 생체 신호를 기록하는 데 유용합니다.
2. 기관 삽관
   1. 기관에 길이 복부 근육의 중앙값 분리 하였다 횡 자궁 피부 절개를, 먼저, 동물의 환기를 위해 카테터를 배치하기 위해서는.
   2. 기관의 등쪽을 통해 봉합하는 통로를 만들 날카로운 집게 반복 개방에 폐쇄 조치를 사용합니다.
   3. t의 기관에 작은 절개를합니다그 복부 측면 약 두 번째 및 세 번째 기관 링 사이, 반원형보다는. 기관 카테터의 고정을 사용하려면, 등의 표면에 노출 된 기관의 충분히 긴 부분을 남겨주세요.
   4. 기관에 2.5-3.0 mm "Y"기관 캐뉼라를 삽입하고 4-0 모노 필라멘트 봉합사 조입니다. 양성 폐 압력을 유지하기 위해 캐 뉼러 물의 6cm로 채워진다 만료 덕트에 접속 병 압력 순환 호흡기에 연결되어 있는지 확인. 실험적으로 달리 언급되지 않으면, 유입 가스는, 산소 100 %이어야한다.
   5. 25 ~ 27 G 바늘 카테터를 삽입하고 쥐의 꼬리 정맥 중 하나에 헤파린 식염수로 가득하고, 테이프를 제자리에 고정합니다.
      주 : 반복 꼬리 정맥 내로 헤파린 염수 소량 주입 과정 전반에 걸쳐 꼬리 정맥 카테터의 개방성을 보장. 또한, 오로 - 기관 내 삽관은 기관의지도를 즉마취 된 동물의 입을 통해 및 기관에 후두 과거 튜브는 여기에 설명되어있는 기관 절개 절차에 대한 가능한 대안이다. 그러나,이 방법은 기관의 손상을 방지하고, 또한 식도 우발적 삽관을 배제하기 위해 특별한 훈련과 경험을 요구한다.
3. 폐 윈도우의 응용 프로그램
   1. 무딘 절개를 이용하여 피부를 분리 한 후 절개를 생성 의해, 전이성 질환이있는 가슴 측으로부터 피부를 제거한다.
      참고 : 피부 절제와 초연 이후 제거 할 수 있습니다
   2. 오버레이 근육 (pectoralis, 앞 톱니와 넓은 등의 dorsi)의 2 층 해부,하지만 그대로 늑간 근육을 두어 진행합니다. 일반적으로 두 개의 인접한 갈비뼈의 일부를 제거하여, 직경 약 1.5 cm의 흉강에 구멍을 만듭니다. 이상적으로, 6, 7 R의 영역에 천공을 찾습니다IBS.
   3. 절골술 :
      1. 폐 표면에 출혈과 손상을 최소화하기 위해 긴밀하게 절삭 가공시에 톱니 수술 집게로 절단 할 수있는 리브를 개최합니다. 수술 용 가위를 이용하여 외부를 가리키는 나머지 갈비뼈의 뾰족한 측 떠나 약 45 °의 각도로, 제 리브의 내측부를 잘랐다.
      2. 이어서, 다시 폐 표면 손상을 방지하기 위해, 바깥쪽으로 가리키는 갈비뼈의 뾰족한 측 남게 유사한 방식 갈비뼈의 측면을 자른다.
      3. 다음 늑간 근육을 잘라 적출 조각을 제거, 인접 리브에 대해이 절차를 반복합니다. 이 과정 중, 폐 표면 및 흉곽 사이의 기계적 상호 작용을 최소화하는 방법으로 폐의 압력을 유지한다. 적절하게 인공 호흡기에 영감 압력을 조절하여이 작업을 수행합니다.
   4. 창 삽입 :
      1. 인 커버 글라스로 구성, 사용자 정의 만든 폐 창을 삽입플렉시 소켓 (그림 1B)에 연결합니다. 아교 접착 또는 진공 그리스의 매우 작은 양을 적용하여 소켓 첨부 창. 전이 표면이 확대 윈도우의 중심에 위치하도록하는 방식으로 윈도우를 삽입한다. 필요한 경우, 각각의면에 구멍을 약간 크게함으로써 윈도우의 중심에 미세 전이를 가지고 삽입 구멍을 조정한다.
         참고 : 흉막 표면에 전이성 질환은 균열을 따라 주로 나타나는 폐 표면의 다른 핑크 - 투 - 연어 색 건강한 부분 내에서 명확하게 인식 할 수있는 흰색 점 또는 지역으로 식별 할 수 있습니다. 미세 전이가 흉막 외부의 다른 영역에서 발생할 수 있지만, 조사 세포주 거의 항상 전이성 질환, 방사선 학적 검출 할 수있게되면, 천공 영역에 미세 전이를 표면화 표시.
      2. 천공 소켓 내로 삽입하고, (L)의 내장 흉막과 직접 접촉을 생성 한 후웅은 4.0 모노 필라멘트 봉합사 (도 1C)를 사용하여, 주변 늑간 근육 창틀의 가장자리를 봉합. 탈출과 도장을 만들 잔여 공기를 돕기 위해 인공 호흡기에 영감 압력의 약간의 증가를 사용합니다.
         주 : 쥐의 호흡률 그것은 70 ~ 90 BPM 사이의 호흡 속도를 조정하기를 권장 등 마취, 흥분하거나 불안 상태, 영감 공기의 산소 농도 (FIO _2)의 상태에 따라 크게 달라질 수있다. 영감 압력은주의 조정해야하지가 약보다 이상으로 설정 될 수있다. 8cm는 H ₂ O (0.6 mmHg로), 폐 표면의 손상을 방지한다.
   5. 형광 현미경, 자동 온도 조절 (전기) 난방 담요에 위치하는 강판에 Z 방향의 운동 (그림 1D)를 제거하기 위해 설계된 맞춤 설계된 제한 수단에 동물을 배치합니다. 동물의 몸을 제어직장 서미스터를 사용하여 온도. 동물의 제한 수단의 나사를 조정하고 인공 호흡기에 영감 압력은 측면 운동의 최적 제어를 달성하기 위해.
      참고 : 양자, dorso - 복부 및 cranio-꼬리 : 포유 동물에서 자연 호흡은 폐의 움직임과 가슴 확장의 세 가지 방향을 포함한다. 최대한 자연스러운 호흡 운동을 유지하기 위해, 필요한 정도까지 Z 방향 압축을 최소화하는 것이 중요하다. Z 차원 구속 혈류 및 다른 매개 변수에 영향을 미칠 수있는 아티팩트를 도입 할 가능성을 가지고 있기 때문에, 동일한 동물에 반복 된 일련의 측정 동안 일정 상태를 유지하는 것이 바람직하다.

4. 이미징 및 측정 미세 혈류의

1. 심장 구멍을 통해 적혈구를 수집하고 전술 한 바와 같이, DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3- = 3 = 테트라 메틸 indocarbocyanine 과염소산 염)로 레이블 ^10.
2. 윈도우 챔버 수술 완료되기 전에 유리 창에 제 1 패스 접착 효과를 피하기 위해, 쥐의 꼬리 정맥에 표시된 적혈구의 300 μl를 주입한다. 정맥 내로 공기의 도입이 더 주입을 억제하므로, 주사기 또는 카테터 내의 공기 방울을 제거한다.
3. 이미지 혈액의 온도를 냉각 -40 ° C 칩에 현미경 CCD 카메라와 흐름, 약 100 배 전체 해상도 (10 배 현미경 목적으로 즉, 10 배 전 카메라의 눈). 표준 로다 민 / TRITC 필터 세트 (여기 450-490 nm의 방출> 515 nm의)를 사용합니다. 결과 이미지 시퀀스의 실제 프레임 속도 및 픽셀 해상도를 기록한다. 스택 당 기록 최소 200 (이상적으로 약 300) 이미지는 유속의 성공적인 분석을 보장합니다.
4. 식염수 IP의 약 1 ml의 모든 시간을 주입하여 동물의 유체 손실을 보충.
   참고 : 개입을 포함 실험 설정, 예를 들어,암전 폐 혈류 속도를 수정 약물은 폐 전이성 암 혈류 속도의 반복 측정이 필요하다. 이러한 확장 실험을 위해, 충분한 유체와 동물을 보충하는 것이 중요하다.
5. 꼬리 정맥에 3N의 KCl 3 ml를 주입하여 동물을 안락사
6. 모든 혈액 흐름에 대한 유속 그레이 스케일과 컬러 인코딩지도 ^{(10, 11)를} 추적 만듭니다 게시, 공개적으로 사용할 수 matlab에 기반 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 이미지 스택을 평가합니다. 그 후, 혈액 세포의 어떤 움직임을 나타 내기 활성 혈관을 즉 없습니다 값을 임계 화 한 후, 같은 이미지 J 같은 상용 또는 공개 된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생성 된 그레이 스케일 이미지를 평가합니다.

결과

고형 종양의 혈관은 굴곡의 큰도, 높은 intervascular 거리 ^(13)을 보여주는 일반 혈액 공급이 크게 다르지 알려져있다. 정상적인 폐 미세 (도 2A, 상부 패널)에 비해 따라서, 실험적인 폐 및 유방암 전이 육종 혈류 트랙 부정형 intervascular 큰 갭 (도 2A, 저급 두 개의 패널)을 갖는다. 이전의 연구에서는 폐 윈도우 방식의 능력은 정상 폐에서 ^열 혈류 속도의 변화를 ...

토론

생체 내에 모델 현미경 전산 혈액 흐름 분석을 사용하여 미세 순환 혈류 및 쥐의 폐 전이에서 다른 동적 공정에서 화상 변경 가능하다 제시된다. 다른 방법은 설치류의 개방 ribcages에 노출 폐에 현미경을 수행하기 위해 존재하지만,이 모델은 폐쇄 가슴 속에서 가슴 벽의 구멍을 통해 이미지 폐 전이에 처음이다. 이 방법을 사용하여, 가능성은 폐 전이의 미세 순환 혈류에 의한 약리학 적 변화를 측?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope