Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas

Resumen

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Resumen

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Introducción

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos relacionados con los animales descritos en este protocolo han sido previamente aprobado por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Duke (DUIACUC).

Cultivo Celular y Inyección 1. Cáncer

1. Cultivar las células cancerígenas metastásicas marcados con fluorescencia (por ejemplo, células de cáncer de mama MDAMB231-GFP humanos, regalo del doctor Patricia Steeg, NCI, y las células del sarcoma de ratón marcado con YFP, regalo del doctor David Kirsch, Duke University Medical Center, Departamento de Oncología Radioterápica) en medio de cultivo adecuado (por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina / estreptavidina) a 37 ° C hasta aproximadamente 90% de confluencia.
2. Tripsinizar las células, lavar 2 veces con PBS, contar, y luego inyectarlos en las venas de la cola de 10 semanas de edad ratas hembra desnudos anestesiados con isoflurano a los 5 millones de células por animal, usando una jeringa con una aguja 27 G. Anesthes nivel quirúrgicosia es verificada por la falta de reacción ante pizca dedo del pie.

2. El seguimiento de las metástasis Usando MicroCT

1. Examinar las ratas una vez a la semana utilizando un micro-CT / micro-irradiador, para detectar la presencia de metástasis por encima de aproximadamente 2 mm de diámetro de diámetro. El micro-CT es comisionado como se describió anteriormente ^12.
   1. Ratas sujetas a 3% anestesia con isoflurano antes de la imagen. Confirmar profunda anestesia por pellizco dedo del pie.
   2. Después de inicio de la anestesia, las ratas transferir rápidamente a la base de formación de imágenes en la cámara de formación de imágenes y conectarse a través de una nariz de cono a una mezcla de isoflurano al aire a 2,5-3%. Ajustar la posición de la rata en la cuna de una manera que el tórax se coloca en el haz de fotones del escáner MicroCT, usando los controles de posición externos y delimitador de láser en la base de formación de imágenes. Asegúrese de que la puerta de la cámara de formación de imágenes está cerrada, para proteger el investigador de los rayos gamma.
   3. Controlar la posición del animal usando de nuevola cámara de vídeo en color. Realizar una baja resolución prueba de imagen de TC, y utilizar la imagen resultante para ajustar el campo de visión a las dimensiones xyz de la cavidad torácica.
   4. Imagen del tórax rata utilizando un filtro Al 2 mm a 40 kVp, 2,5 mA, y 0.008 voxel a las 7 FPS y devolver el animal a su jaula. Obtención de imágenes de un animal debe tener no más de 15 o 20 min. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
   5. Confirme metástasis por la aparición de objetos relativamente de radio-opaco que no puede ser explicado por los vasos sanguíneos intratorácicos (Figura 1)

Cirugía 3. Cámara Ventana

1. Anestesia, signos vitales y cateterización de la vena de la cola
   1. Seleccione animales con presencia de enfermedad metastásica. Inyectar animal con un d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia nivel quirúrgico por pizca dedo del pie antes de proceder.
      Nota: Los protocolos de anestesia deben ser adaptadas a la respectiva configuración experimental. Pentobarbital fue elegido aquí como un anestésico de acción prolongada, con el fin de inducir la anestesia profunda para largos procedimientos, al tiempo que ofrece la opción de re-facile de dosificación. Sin embargo, la pérdida de animales para la sobredosificación es un problema común con anestesia con pentobarbital. Otra opción que conserva reflejos autonómicos en un grado mayor que pentobarbital es la ketamina en combinación con sedantes tales como xilazina o medetomidina, que sin embargo permite sólo para un único ciclo de re-dosificación.
   2. Afeitado animales en el lado del cuerpo que tiene la enfermedad metastásica, y en la zona del cuello, usando una maquinilla. Limpie todo el pelo suelto que queda de la piel. Después se elimina el pelo suelto, aplique ungüento veterinario para los ojos, para evitar que se sequen.
      NOTA: ratas desnudas Athymic pueden tener el pelo residual que REQUIeliminación res antes de proceder con los procedimientos quirúrgicos. Es muy importante eliminar todo el pelo a fondo, ya que puede interferir con los procedimientos quirúrgicos y de formación de imágenes.
   3. Fijar el animal en posición supina sobre una placa de metal que se coloca en una almohadilla de calefacción 37 ° C el agua recirculada. Las extremidades delanteras y traseras son fijos en el plato con cinta.
      NOTA: Es útil para controlar y registrar los signos vitales, tales como la frecuencia cardíaca y la oxigenación de la sangre arterial mediante el uso de un oxímetro de pulso, a través de procedimientos quirúrgicos y experimentales.
2. La intubación traqueal
   1. Para colocar un catéter para la ventilación del animal, primero hacer una incisión transversal de la piel cervical, seguido por la separación mediana de la musculatura longitudinal ventral a la tráquea.
   2. Utilice acción repetida-apertura al cierre con un afilados fórceps para crear un paso para la sutura a través de la cara dorsal de la tráquea.
   3. Hacer una pequeña incisión en la tráquea en tél lado ventral, no más de semi-circular, aproximadamente entre el segundo y el tercer anillo traqueal. Deja un parte suficientemente larga de la tráquea expuesta en la superficie dorsal, para permitir la fijación del catéter traqueal.
   4. Inserte un 2,5 a 3,0 mm "Y" cánula traqueal en la tráquea, y apriete con una sutura monofilamento 4-0. Asegúrese de que la cánula está conectado a un ventilador ciclado de presión con una botella conectada al conducto de caducidad que se llena de 6 cm de agua, para mantener la presión pulmonar positivo. Corriente de llenado de gas debe ser de 100% de oxígeno, a menos experimentalmente deseado lo contrario.
   5. Insertar un catéter con una aguja G 25-27, y llena con solución salina heparinizada en una de las venas de la cola de la rata, y fijar en su lugar con cinta adhesiva.
      NOTA: Asegúrese de que la permeabilidad del catéter vena de la cola durante todo el procedimiento mediante inyecciones repetidas de una pequeña cantidad de solución salina heparinizada en la vena de la cola. Además, la intubación oro-traqueal, es decir, la orientación de un traquealtubo a través de la boca del animal anestesiado y más allá de la laringe dentro de la tráquea, es una posible alternativa al procedimiento de traqueotomía que se describe aquí. Sin embargo, este método requiere entrenamiento y experiencia especial, para evitar daños a la tráquea, y también para evitar la canulación accidental del esófago.
3. Aplicación de ventana pulmonar
   1. Quitar la piel desde el lado del pecho donde se encuentra la enfermedad metastásica, mediante la creación de una incisión y, a continuación, separando la piel mediante disección roma.
      Nota: La piel puede ser extirpado y se retira posterior al desprendimiento
   2. Proceder mediante la disección de las dos capas de la superposición de la musculatura (pectoral, serrato, y dorsal ancho), pero dejando los músculos intercostales intacto. Crear una perforación en la cavidad del pecho de aproximadamente 1,5 cm de diámetro, mediante la eliminación de porciones de típicamente dos costillas adyacentes. Lo ideal es ubicar la perforación de la región de la sexta y séptima ribs.
   3. Osteotomía:
      1. Para minimizar el sangrado y el daño a la superficie del pulmón, sujeta fuertemente la costilla que se corta con un fórceps quirúrgico dentadas durante el corte. Usando tijeras quirúrgicas, corte el lado medial de la primera costilla, en un ángulo de aproximadamente 45 °, dejando el lado puntiagudo del hueso de la costilla restante apuntando hacia el exterior.
      2. Posteriormente, cortar el lado lateral de la costilla de una manera similar, dejando de nuevo el lado puntiagudo del hueso de la costilla apunta hacia afuera, para evitar daños en la superficie del pulmón.
      3. Repita el procedimiento para la costilla adyacente, a continuación, cortar los músculos intercostales y retire la pieza extirpada. Durante este procedimiento, mantener la presión pulmonar de una manera que la interacción mecánica entre la superficie del pulmón y la caja torácica se reduce al mínimo. Para ello, la regulación apropiada de presión inspiración en el ventilador.
   4. La inserción de la ventana:
      1. Inserte una ventana de pulmón por encargo, que consta de un cubreobjetos que esunido a una toma de Plexiglas (Figura 1B). Coloque la ventana a la toma por encolado, o mediante la aplicación de una cantidad muy pequeña de grasa de vacío. Inserte la ventana de manera que las metástasis de superficie se encuentran cerca del centro de la ventana. Si es necesario, ajustar el agujero insertado para llevar la micrometástasis en el centro de la ventana mediante la ampliación del agujero ligeramente hacia el lado respectivo.
         NOTA: La enfermedad metastásica en la superficie pleural se puede identificar como puntos blancos claramente reconocibles o áreas dentro de las partes sanas de color rosa de lo contrario-a-salmón de la superficie pulmonar que aparecen predominantemente a lo largo de las fisuras. Mientras micrometástasis pueden ocurrir en otras áreas del exterior pleural, las líneas celulares investigadas casi siempre muestran la superficie micrometástasis en el área perforada, una vez que la enfermedad metastásica puede ser detectada radiológicamente.
      2. Después de insertar el enchufe en la perforación, y la creación de un contacto directo con la pleura visceral de la lung, la sutura de los bordes del marco de la ventana en el músculo intercostal circundante, utilizando 4,0 sutura de monofilamento (Figura 1C). Utilice un ligero aumento de la presión de inspiración en el ventilador para ayudar a aire residual escapar y para crear un sello.
         Nota: La tasa de respiración de ratas puede variar mucho, dependiendo del estado de la anestesia, el estado de excitación o la ansiedad, la concentración de oxígeno en el aire inspirado (FiO _2), etc. Es recomendable ajustar la tasa de respiración de 70 a 90 latidos por minuto. La presión de inspiración se debe ajustar con precaución y no se puede ajustar a más de aprox. 8 cm H ₂ O (0,6 mmHg), para evitar daños en la superficie del pulmón.
   5. Coloque el animal en un limitador de diseño personalizado que está diseñado para eliminar la dirección Z movimiento (Figura 1D) en una placa de acero que se coloca en un termostática (eléctrica) manta de calefacción, bajo un microscopio de fluorescencia. Controlar el cuerpo del animalla temperatura usando un termistor rectal. Ajuste los tornillos de la inmovilización de los animales, y la presión de inspiración en el ventilador para lograr un control óptimo de movimiento lateral.
      Nota: la respiración natural en mamíferos involucra a los tres sentidos de circulación pulmonar y la extensión del pecho:, dorso-ventral, y cráneo-caudal bilateral. Con el fin de preservar el movimiento de la respiración natural tanto como sea posible, es importante para reducir al mínimo la compresión de la dirección Z en la medida necesaria. Debido a la restricción-Z dimensiones tiene el potencial de introducir artefactos que puedan afectar el flujo de sangre y otros parámetros, es aconsejable mantener condiciones constantes durante la serie de mediciones repetidas en el mismo animal.

4. Imaging y medición de flujo sanguíneo en la microcirculación

1. Recoger las células rojas de la sangre a través de punción cardíaca y etiquetarlos con DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 perclorato =, 3 = tetrametil-indocarbocianina), como se describió anteriormente ^10.
2. Inyectar 300 l de glóbulos rojos marcados en la vena de la cola de la rata antes de realizar la cirugía de la cámara de ventana, para evitar efectos de adhesión pase primero a la ventana de cristal. Eliminar cualquier burbuja de aire en la jeringa o un catéter, como la introducción de aire en la vena inhibirá cualquier inyecciones adicionales.
3. Image flujo de sangre con una cámara CCD microscopio a -40 ° C chip de temperatura de enfriamiento, y aproximadamente 100X resolución global (es decir, con un objetivo de microscopio 10X, 10X y pre-cámara ocular). Utilice conjuntos de filtros Rodamina / TRITC estándar (450-490 nm de excitación, emisión> 515 nm). Registre la resolución real de las secuencias de imágenes resultantes velocidad de fotogramas y pixel. Consigue al menos 200 (idealmente alrededor de 300) imágenes por pila, para garantizar el éxito del análisis de la velocidad del flujo.
4. Reponer la pérdida de líquidos en el animal mediante la inyección de aproximadamente 1 ml de solución salina IP cada hr.
   NOTA: Los valores experimentales que implican una intervención, por ejemplo,un fármaco que modifica la velocidad del flujo sanguíneo en una metástasis del cáncer pulmonar, requiere mediciones repetidas de la velocidad del flujo de sangre en el cáncer metastásico pulmonar. Para estos experimentos prolongados, es importante para reponer el animal con suficiente líquido.
5. La eutanasia a los animales por infusión de 3 ml de 3N KCl en la vena de la cola
6. Evaluar las pilas de imágenes utilizando un publicada, disponible públicamente algoritmo informático basado en Matlab que va a crear el flujo de escala de grises de velocidad y mapas de color codificado para todo el flujo de sangre rastros ^10,11. Posteriormente evaluar las imágenes en escala de grises resultantes por el uso de software de análisis de imagen comercial o de acceso público, tales como la imagen J, después de thresholding de valores que indican ningún movimiento de las células de la sangre, es decir, sin vasculatura activo.

Resultados

La vasculatura en tumores sólidos se sabe que difieren significativamente de suministro normal de sangre, mostrando un mayor grado de tortuosidad y mayores distancias intervasculares ^13. En consecuencia, las pistas del flujo sanguíneo en metástasis de cáncer de mama y el sarcoma pulmonar experimental tienen formas irregulares y grandes lagunas intervasculares (Figura 2A, dos paneles inferiores) cuando se compara con la microcirculación pulmonar normal (Figura 2A, panel s...

Discusión

Se presenta un modelo que es factible cambios de imagen en el flujo sanguíneo en la microcirculación y otros procesos dinámicos en las metástasis pulmonares de ratas, usando microscopía intravital y análisis de flujo de sangre computacional. Si bien existen otros métodos para llevar a cabo la microscopía en pulmones expuestos en ribcages abiertos de los roedores, este modelo también es la primera imagen de metástasis pulmonares a través de una perforación de la pared del pecho en un entorno de pecho cerrado....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope