Automated Misura di microcircolatorio Portata in polmonare Metastasi di Ratti

Riepilogo

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Abstract

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Introduzione

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali relative descritte in questo protocollo sono stati precedentemente approvati dal Institutional Animal Care and Use Committee Duke University (DUIACUC).

1. Cancer Cell Culture e iniezione

1. Coltivare cellule tumorali metastatiche fluorescente (ad esempio le cellule del cancro al seno MDAMB231-GFP umani, dono di Dr. Patricia Steeg, NCI, e le cellule del mouse sarcoma YFP-etichettati, dono del Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Dipartimento di Radioterapia Oncologica) in appropriato terreno di coltura (per es Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptavidina) a 37 ° C fino a circa il 90% confluenti.
2. Trypsinize cellule, lavarli 2 volte con PBS, contare, e poi iniettarli nelle vene coda di isoflurano-anestetizzato 10 settimane ratti nudi femminili a 5 milioni di cellule per animale, usando una siringa con un ago 27 G. Anesthes livello chirurgiciia viene verificata dalla mancanza di reazione al pizzico punta.

2. Monitoraggio delle metastasi Uso microCT

1. Esaminate ratti volta alla settimana usando un micro-CT / micro-irradiatore, per rilevare la presenza di metastasi sopra di circa 2 mm di diametro di diametro. Il micro-CT è incaricato come descritto in precedenza ^12.
   1. Ratti soggetto a 3% isoflurano anestesia prima di imaging. Confermare profonda anestesia pizzico punta.
   2. Dopo insorgenza dell'anestesia, trasferire rapidamente i ratti alla culla di imaging nella camera di imaging e connettersi tramite un naso-cono per una miscela isoflurano-aria a 2,5-3%. Regolare la posizione del ratto in culla in modo che il suo torace è in posizione nel fascio di fotoni dello scanner microCT, utilizzando i comandi di posizione esterni e delimitatore laser sul supporto imaging. Assicurarsi che la porta della camera di imaging è chiusa, per proteggere l'investigatore dai raggi gamma.
   3. Controllare la posizione dell'animale utilizzando nuovamentela telecamera a colori. Eseguire un test di imaging CT a bassa risoluzione, e utilizzare l'immagine risultante per regolare il campo visivo alle dimensioni XYZ della cavità toracica.
   4. Immagine torace topo usando un filtro Al 2 mm 40 kVp, 2,5 mA, e 0.008 voxel a 7 FPS e rispedire l'animale nella sua gabbia. Imaging di un animale dovrebbe prendere non più di 15 o 20 minuti. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
   5. Conferma metastasi dalla comparsa di oggetti relativamente radiopachi che non può essere spiegato da vasi sanguigni intratoracica (Figura 1A)

Chirurgia 3. Finestra Camera

1. Anestesia, segni vitali e cateterizzazione coda vena
   1. Selezionare gli animali con la presenza di malattia metastatica. Iniettare animale con un d intraperitonealeose di 50 mg / kg pentobarbital. Conferma a livello chirurgico anestesia pizzico punta prima di procedere.
      Nota: i protocolli di anestesia dovrebbero essere abbinati al rispettivo apparato sperimentale. Pentobarbital stato scelto qui come anestetico ad azione prolungata, per indurre anestesia profonda per lunghe procedure, offrendo la possibilità di facile ri-somministrazione. Tuttavia, la perdita di animali da sovradosaggio è un problema comune con anestesia pentobarbital. Un'altra opzione che conserva riflessi autonomi in misura maggiore di pentobarbital è ketamina in combinazione con sedativi come la xilazina o medetomidina, che però consente solo per un singolo ciclo di ri-dosaggio.
   2. Rasatura animali sul lato del corpo che ha la malattia metastatica, e nella zona del collo, utilizzando un clipper. Rimuovere tutti i restanti capelli sciolti dalla pelle. Dopo capelli sciolti viene rimosso, applicare una pomata veterinari per gli occhi, per evitare che si secchi.
      NOTA: i topi nudi atimici possono avere capelli residuo requirimozione res prima di procedere con procedure chirurgiche. E 'molto importante rimuovere completamente tutti i capelli, come può interferire con le procedure chirurgiche e di imaging.
   3. Fissare l'animale in posizione supina su una piastra di metallo che è posto su una piastra elettrica dell'acqua 37 ° C circolare. Le estremità anteriori e posteriori sono fissati sulla piastra con nastro.
      NOTA: E 'utile per controllare e registrare i segni vitali, come i tassi di cuore e sangue arterioso ossigenazione utilizzando un pulsossimetro, durante le procedure chirurgiche e sperimentali.
2. L'intubazione tracheale
   1. Per posizionare un catetere per la ventilazione dell'animale, prima una incisione cutanea cervicale trasversale, seguita dalla separazione mediana della muscolatura ventrale longitudinale alla trachea.
   2. Utilizzare ripetuta azione di apertura a chiusura con una pinza taglienti per creare un passaggio per la sutura attraverso il lato dorsale della trachea.
   3. Fai una piccola incisione nella trachea su tegli lato ventrale, non superiore semicircolare, circa tra il secondo e il terzo anello tracheale. Lasciare sufficientemente lunga porzione della trachea esposta sulla superficie dorsale, per consentire il fissaggio del catetere tracheale.
   4. Inserire una 2,5-3,0 mm "Y" cannula tracheale nella trachea, e stringere con una sutura 4-0 monofilamento. Verificare la cannula è collegata ad un ventilatore ciclato a pressione con una bottiglia collegata al condotto di scadenza che viene riempito con 6 cm di acqua, per mantenere la pressione polmonare positiva. Flusso gas deve essere al 100% di ossigeno, a meno che sperimentalmente desiderato altrimenti.
   5. Inserire un catetere con un ago G 25-27, e riempito di soluzione fisiologica eparinizzata in una delle vene coda di ratto, e fissare in posizione con nastro.
      NOTA: Assicurare la pervietà del catetere vena della coda per tutta la procedura iniettando ripetutamente una piccola quantità di soluzione fisiologica eparinizzata nella vena della coda. Inoltre, intubazione oro-tracheale, cioè la guida di un trachealetubo attraverso la bocca dell'animale anestetizzato e passato laringe nella trachea, è una possibile alternativa alla procedura tracheotomia descritta qui. Tuttavia, questo metodo richiede formazione e dell'esperienza specifica, per evitare danni alla trachea, e anche per impedire la cannulazione accidentali dell'esofago.
3. Applicazione della finestra polmonare
   1. Rimuovere la pelle dal lato del torace in cui si trova la malattia metastatica, creando una incisione, e poi staccare la pelle con dissezione smussata.
      Nota: La pelle può essere eliminata e rimossa successivamente al distacco
   2. Procedere sezionando i due strati di muscolatura sovrapposizione (pettorale, dentato, e gran dorsale), ma lasciando intatti i muscoli intercostali. Creare una perforazione nella cavità toracica di circa 1,5 cm di diametro, rimuovendo porzioni tipicamente due nervature adiacenti. Idealmente, individuare la perforazione della regione della sesta e settima ribs.
   3. Osteotomia:
      1. Per ridurre al minimo il sanguinamento e danni alla superficie del polmone, ermeticamente tenere la nervatura da tagliare con dentate pinza chirurgica durante il taglio. Usando forbici chirurgiche, tagliare il lato mediale della nervatura prima, con un angolo di circa 45 °, lasciando la parte appuntita della costola rimanente indica all'esterno.
      2. Successivamente, tagliare la parte laterale della costola in modo simile, lasciando ancora la parte appuntita della costola punta verso l'esterno, per evitare danni alla superficie del polmone.
      3. Ripetere la procedura per la nervatura adiacente, quindi tagliare i muscoli intercostali e togliere il pezzo asportato. Durante questa procedura, mantenere la pressione polmonare in modo che l'interazione meccanica tra la superficie polmonare e la gabbia toracica è minimizzato. Per fare ciò, opportunamente regolare la pressione ispirazione sul ventilatore.
   4. Inserimento della finestra:
      1. Inserire una finestra polmone misura, costituito da un coprioggetti che èattaccato ad una presa plexiglas (Figura 1B). Fissare la finestra alla presa mediante incollaggio, oppure applicando una piccola quantità di grasso per vuoto. Inserire la finestra in modo che le metastasi superficiali sono situati vicino al centro della finestra. Se necessario, regolare il foro inserito per portare la micrometastasi al centro della finestra allargando leggermente il foro al rispettivo lato.
         NOTA: La malattia metastatica sulla superficie pleurica può essere identificato come puntini bianchi chiaramente riconoscibili o aree all'interno delle parti altrimenti rosa-a-salmone colorati sani della superficie polmonare che appaiono prevalentemente lungo le fessure. Mentre micrometastasi possono verificarsi in altri settori dell'esterno pleurico, le linee cellulari esaminati mostrano quasi sempre affioramento micrometastasi nell'area perforata, una volta metastasi può essere rilevato radiologicamente.
      2. Dopo aver inserito la presa nella perforazione, e creando il contatto diretto con la pleura viscerale lung, suturare i bordi della cornice della finestra al muscolo intercostali circostante, utilizzando 4,0 sutura monofilamento (Figura 1C). Utilizzare un leggero aumento della pressione di inspirazione del ventilatore per aiutare aria residua di fuggire e per creare una tenuta.
         Nota: Il tasso di respirazione di ratti può variare notevolmente, a seconda dello stato di anestesia, lo stato di eccitazione o ansia, concentrazione di ossigeno dell'aria inspirata _(FiO2), ecc E 'consigliabile regolare la frequenza respiratoria tra 70 e 90 bpm. La pressione ispirazione deve essere regolata con cautela e non può essere impostato a più di ca. 8 centimetri H ₂ O (0,6 mmHg), per evitare danni alla superficie del polmone.
   5. Posizionare l'animale in un dispositivo di immobilizzazione progettato su misura che è progettato per eliminare Z-direzionale movimento (Figura 1D) su una piastra di acciaio che è posizionato su un termostatica (elettrica) termocoperta, sotto un microscopio a fluorescenza. Controllare il corpo dell'animaletemperatura con un termistore rettale. Regolare le viti del dispositivo di immobilizzazione degli animali, e la pressione di inspirazione del ventilatore per ottenere il controllo ottimale di movimento laterale.
      Nota: la respirazione naturale in mammiferi coinvolge tutte e tre le direzioni di movimento del polmone e l'estensione del torace: bilaterali, dorso-ventrale, e cranio-caudale. Per preservare il movimento respirazione naturale per quanto possibile, è importante minimizzare la compressione Z-direzionale nella misura necessaria. Poiché il sistema di ritenuta Z-dimensionale ha il potenziale per introdurre artefatti che possono influenzare il flusso di sangue e altri parametri, si consiglia di mantenere le condizioni di costante durante serie di misure ripetute dello stesso animale.

4. Imaging e misurazione del flusso sanguigno Microcircolatoria

1. Raccogliere i globuli rossi tramite puntura cardiaca ed etichettarli con DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 perclorato =, 3 = tetrametil-indocarbocyanine), come descritto in precedenza ^10.
2. Iniettare 300 ml di globuli rossi marcati nella vena della coda del topo prima dell'intervento camera di finestra è fatta, per evitare effetti primo passaggio adesione alla finestra di vetro. Eliminare eventuali bolle d'aria nella siringa o del catetere, come introduzione di aria nella vena inibirà ulteriori iniezioni.
3. Immagine flusso di sangue con una telecamera CCD microscopio a -40 ° C di temperatura di raffreddamento di chip, e circa 100X risoluzione complessiva (cioè con un obiettivo microscopio 10X, 10X e pre-camera oculare). Utilizzare set di filtri Rhodamine / TRITC normali (eccitazione 450-490 nm, emissione> 515 nm). Registrare il frame rate e pixel la risoluzione effettiva delle sequenze di immagini risultanti. Record di almeno 200 (idealmente circa 300) le immagini per stack, per garantire l'analisi di successo della velocità del flusso.
4. Rifornire perdita di liquidi negli animali iniettando circa 1 ml di soluzione fisiologica ip ogni hr.
   NOTA: Le impostazioni sperimentali che coinvolgono un intervento, ad esempio,un farmaco che modifica la velocità del flusso sanguigno in una metastasi del cancro polmonare, richiede misurazioni ripetute di velocità del flusso sanguigno nel tumore metastatico polmonare. Per questi esperimenti estesi, è importante ricostituire l'animale con sufficiente liquido.
5. Euthanize animali per infusione di 3 ml di 3N KCl nella vena della coda
6. Valutare le pile di immagini utilizzando una pubblicazione, pubblicamente disponibile algoritmo computer basato su Matlab che creerà il flusso di velocità in scala di grigi ea colori codificati mappe per tutto il flusso di sangue tracce ^10,11. Successivamente valutare le risultanti immagini in scala di grigi utilizzando software di analisi dell'immagine commerciale o pubblicamente disponibili, come ad esempio Immagine J, dopo thresholding off valori che indicano nessun movimento di cellule del sangue, cioè non vascolare attiva.

Risultati

La vascolarizzazione nei tumori solidi è noto a differire significativamente da normale apporto di sangue, mostrando maggiori gradi di tortuosità, e superiori distanze InterVascular ^13. Di conseguenza, le tracce del flusso sanguigno nel cancro al seno e sarcoma metastasi polmonari sperimentali hanno forme irregolari e grandi lacune InterVascular (figura 2A, inferiori di due pannelli) rispetto alla microcircolazione polmonare normale (Figura 2A, pannello superiore). In uno s...

Discussione

Un modello che viene presentato è fattibile immagine cambia in microcircolazione del flusso sanguigno e altri processi dinamici in metastasi polmonari di ratti, utilizzando la microscopia intravitale e analisi del flusso di sangue computazionale. Mentre altri metodi esistono per effettuare microscopia a polmoni esposte in ribcages aperti di roditori, questo modello è anche il primo ad immagine metastasi polmonari attraverso una perforazione della parete toracica in un ambiente chiuso del torace. Usando questo metodo, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope