Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Özet

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Özet

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Giriş

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare^1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment^3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field⁵. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment^6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung^7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy¹⁰. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung¹¹. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

Protokol

NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan ilgili prosedürler önceden Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (DUIACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Kanser Hücre Kültürü ve Enjeksiyon

1. Floresan etiketli metastatik kanser hücrelerini Yetiştirmek (örn insan MDAMB231-GFP meme kanseri hücreleri, Dr. Patricia Steeg, NCI ve YFP etiketli fare sarkomu hücreleri, Dr David Kirsch, Duke Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Radyasyon Onkolojisi Bölümü'nden hediye hediye) Uygun bir kültür ortamında (örneğin, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptavidin ile (DMEM)), 37 ° C 'de yaklaşık olarak% 90, birbirine karışana kadar.
2. Hücreleri Trypsinize PBS ile onları 2 kez yıkayın, saymak, ve sonra bir 27 G iğne ile bir şırınga kullanarak, hayvan başına 5 milyon hücre izofluran-anestezi 10 haftalık dişi çıplak sıçanların kuyruk damarlar içine enjekte edilir. Cerrahi düzey anesthesia ayak tutam tepki eksikliği tarafından doğrulanmadı.

Metastaz kullanma mikroBT 2. İzleme

1. Metastaz çapı çapı yaklaşık 2 mm varlığını tespit etmek için, bir mikro-CT / mikro ışınlayıcı kullanılarak haftada bir sıçan inceleyin. Daha önce açıklandığı gibi ¹² mikro-BT devreye alınmıştır.
   1. Görüntüleme önce% 3 izofluran anestezisi Konu fareler. Ayak tutam derin anestezi onaylayın.
   2. Anestezi başlangıcından sonra, hızla görüntüleme odasında görüntüleme beşiğine sıçan aktarmak ve% 2.5-3 bir izofluran-hava karışımı bir burun-koni aracılığıyla bağlayın. Görüntüleme beşiği harici pozisyon kontrolleri ve lazer sınırlayıcı kullanarak, kendi toraks mikroBT tarayıcının foton ışın konumlandırılmış bir şekilde beşikte sıçan konumunu ayarlayın. Gama ışınlarından araştırmacı kalkan, görüntüleme odasının kapısını kapalı olduğundan emin olun.
   3. Yine kullanarak hayvanın konumunu kontrolrenkli video kamera. Düşük çözünürlüklü BT görüntüleme deneme sürüşü gerçekleştirin ve göğüs boşluğunun xyz boyutlarına görüş alanını ayarlamak için çıkan görüntü kullanın.
   4. Görüntü sıçan 40 kVp bir 2 mm Al filtre kullanılarak toraks, 2.5 mA ve 7 FPS 0.008 Vokseller ve kafesine hayvan dönün. Bir hayvanın Görüntüleme en fazla 15 ya da 20 dakika sürer. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın.
   5. Intratorasik kan damarları tarafından izah edilemez nispeten radyo-opak nesnelerin görünümünü tarafından metastaz onaylayın (Şekil 1A)

3. Pencere Odası Cerrahisi

1. Anestezi, vital bulgular ve kuyruk ven kateterizasyonu
   1. Metastatik hastalık varlığı ile hayvanları seçin. Bir karın içi d hayvan enjekte50 mg / kg pentobarbital ose. Devam etmeden önce ayak tutam cerrahi düzey anestezi onaylayın.
      Not: Anestezi protokolleri ilgili deney düzeneği uygun olmalıdır. Kolay yeniden doz seçeneği sunarken Pentobarbital, uzun prosedürler için derin anestezi uyarmak için, uzun etkili anestetik olarak burada seçildi. Ancak, doz aşımı hayvanların kaybı pentobarbital anestezi ile ortak bir sorundur. Pentobarbital daha büyük bir dereceye kadar otonom refleksleri koruyan Başka bir seçenek de, ancak sadece tek bir yeniden dozaj çevrimi için izin iksilazin ya da medetomidin gibi sedatif ile kombinasyon halinde ketamin olup.
   2. Bir clipper kullanarak, metastatik hastalık vardır, ve boyun bölgesinde vücudun yan tarafında hayvanlar Tıraş. Cilt kalan tüm gevşek saç silin. Gevşek saç kaldırıldıktan sonra, kurumasını önlemek için, gözlere veteriner merhem uygulayın.
      NOT: Atimik çıplak sıçanlar requi artık saç olabilircerrahi işlemlerde devam etmeden önce res kaldırma. Cerrahi prosedürler ve görüntüleme müdahale edebilir gibi, iyice tüm saç kaldırmak için çok önemlidir.
   3. 37 ° C su sirküle ısıtma yastığı yerleştirilmiş bir metal plaka üzerinde bir yatar pozisyonda hayvan Fix. Ön ve arka ekstremite bant ile plaka üzerine sabitlenir.
      NOT: Bu kontrol ve cerrahi ve deneysel prosedürler boyunca, bir pulse oksimetre ile kalp oranları ve arteriyel kan oksijenlenme gibi vital bulguları, kayıt yararlıdır.
2. Trakeal entübasyon
   1. Trakea uzunlamasına kas ventral median ayrılması ardından çapraz servikal cilt kesisi, ilk, hayvanın havalandırma için bir kateter yerleştirmek yapmak için.
   2. Trakea dorsal tarafı ile dikiş için bir geçiş oluşturmak için keskin bir forseps ile tekrarlanan açılış-to-kapama eylemini kullanın.
   3. T trakea içine küçük bir kesi yapınO ventral yüzü, yaklaşık olarak ikinci ve üçüncü trakeal halka arasında, yarı dairesel daha fazla olamaz. Trakeal kateterin tespit sağlamak için, dorsal yüzeyi üzerinde açığa trakea yeterince uzun bir bölümü bırakın.
   4. Trakea içine 2,5-3,0 mm "Y" trakeal kanül yerleştirin ve 4-0 monofilament sütür ile sıkın. Pozitif akciğer basıncını sağlamak için, kanül su 6 cm ile doludur son kanalına bağlı bir şişe basınç devirli ventilatöre bağlı olduğundan emin olun. Deneysel aksi istenen sürece akan gaz,% 100 oksijen olmalıdır.
   5. Bir 25-27 G iğne ile bir kateter yerleştirin ve sıçan kuyruğu damarlar birine heparinli serum fizyolojik ile doldurulur, ve bant ile yerde sabitleyin.
      NOT: arka arkaya kuyruk damarından heparinli tuz az miktarda enjekte edilerek işlem boyunca kuyruk damarı kateterinin açıklığını sağlamak. Ayrıca, oro-entübasyon, bir trakeal rehberlik yanianestezi verilen hayvanın ağız yoluyla ve nefes borusu içine gırtlak geçen tüp, burada açıklanan traketomi edilen prosedüre de bir olası alternatiftir. Ancak, bu yöntem trakea zarar görmesini önlemek için, ve aynı zamanda yemek borusu yanlışlıkla kanül engelleyecek, özel eğitim ve deneyim gerektirir.
3. Pulmoner pencere Uygulaması
   1. Künt diseksiyon kullanarak cilt ayırma sonra bir kesi oluşturarak, tarafından, metastatik hastalık bulunduğu göğüs tarafındaki deriyi çıkarın.
      Not: Cilt çıkarıldı ve dekolmanı sonraki kaldırılabilir
   2. Bindirilirken kas (pektoralis, serratus ve latissimus dorsi) iki kat diseksiyon, ama sağlam interkostal kasları bırakarak devam edin. Tipik olarak, iki bitişik kaburga kısımları bertaraf eder, çap olarak yaklaşık 1.5 cm göğüs boşluğunda bir delik oluşturur. İdeal olarak, altıncı ve yedinci r bölgenin perforasyon bulunibs.
   3. Osteotomi:
      1. Akciğer yüzeyine kanama ve zararı en aza indirmek için, sıkı kesme sırasında bir dişli cerrahi forseps ile kesilecek kaburga tutun. Cerrahi makas kullanılarak, dış işaret kalan kaburga kemiği sivri bir kenar bırakan, yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile, ilk kaburga medial yan kesti.
      2. Daha sonra, yeniden akciğer yüzeyine zarar görmesini önlemek için, dışarı doğru bakan kabartma kemikten sivri bir kenar bırakan, benzer bir şekilde, kaburga kemiği yanal kenarını.
      3. Daha sonra interkostal kasları kesmek ve kesilmiş parça kaldırın, komşu kaburga için işlemi tekrarlayın. Bu prosedür sırasında, akciğer yüzey ve göğüs kafesi arasında mekanik bir etkileşim en aza indirecek bir şekilde akciğer basınç sağlar. Uygun ventilatöre ilham basıncını düzenleyerek bunu yapın.
   4. Pencerenin yerleştirilmesi:
      1. Bir coverglass oluşan bir özel yapılmış akciğer penceresini takınbir pleksiglas soketi (Şekil 1B) eklenmiş. , Yapıştırma ya da vakum yağ çok az miktarda uygulanarak sokete pencere takın. Yüzey metastazları yakın pencerenin merkezine yer almaktadır bir şekilde pencereyi yerleştirin. Gerektiği taktirde ilgili tarafına hafifçe delik genişletilirse, pencerenin merkezi Mikrometastaz getirmek için eklenen bir delik ayarlayın.
         NOT: Plevral yüzeyde Metastatik hastalık çatlaklar boyunca ağırlıklı olarak görünen akciğer yüzeyinin aksi pembe-to-somon renkli sağlıklı parçalarının içinde açıkça tanınabilir beyaz noktalar veya alanlar olarak tespit edilebilir. Mikrometastazlar plevra dış diğer alanlarda oluşabilir iken, incelenen hücre çizgileri hemen hemen her zaman metastatik hastalık radyolojik tespit edilebilir kez delinmiş alanda mikrometastazları yüzey görüntüler.
      2. Perforasyon içine soketi takarken, ve l viseral plevra ile doğrudan temas oluşturduktan sonraung, 4.0 monofilament sütür (Şekil 1C) kullanarak, çevredeki interkostal kas pencere çerçevesinin kenarlarını dikin. Kaçmak ve bir mühür oluşturmak için artık havayı yardımcı ventilatöre ilham basınç hafif bir artış kullanın.
         Not: sıçanların solunum hızı 70 ile 90 bpm arasında solunum hızını ayarlamak için tavsiye vb anestezi, heyecan veya anksiyete durumu, solunan havanın oksijen konsantrasyonu _(FiO2), durumuna bağlı olarak, büyük ölçüde değişebilir. ilham basıncı dikkatle ayarlanmalıdır ve yaklaşık fazla ayarlanmalıdır. 8 cm _H2O (0.6 mm Hg), akciğer yüzeyine zarar görmesini önlemek için.
   5. Flöresanlı bir mikroskop altında, bir termostatik (elektrik) ısıtma battaniyesi üzerine yerleştirilen bir çelik plaka ile Z-yönlü hareketi (Şekil 1D) ortadan kaldırmak için tasarlanmıştır özel olarak tasarlanmış süzgeç hayvan yerleştirin. Hayvanın vücudu kontrolrektal termistör kullanarak sıcaklığı. Hayvan süzgeç vidalarını ayarlayın ve ventilatöre ilham basıncı yanal hareket optimal kontrolü sağlamak için.
      Not: ikili, dorso-ventral ve kranyokaudal: memelilerde Doğal solunum akciğer hareketi ve göğüs uzantısı üç yön içerir. Mümkün olduğunca doğal bir solunum hareketi korumak için, gerekli ölçüde Z yönlü sıkıştırma en aza indirmek için önemlidir. Z-boyutlu emniyet kan akışını ve diğer parametreleri etkileyebilir eserleri tanıtmak potansiyeline sahip olduğundan, aynı hayvanda tekrarlayan ölçümler dizi boyunca sürekli koşullarını tutmak için tavsiye edilir.

4. Görüntüleme ve Ölçüm Mikrosirkülasyonda Kan Akımının

1. Kalp ponksiyonu ile kırmızı kan hücreleri toplamak ve daha önce tarif edildiği gibi, DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = 3 = tetrametil-indokarbosiyanin perklorat) ile etiket ^10.
2. Pencere bölmesi ameliyatı yapılır önce cam pencere için ilk geçiş yapışma etkilerini önlemek için, sıçanın kuyruk venine işaretli kırmızı kan hücrelerinin 300 ul enjekte edilir. Ven içine hava giriş başka enjeksiyon inhibe gibi, şırınga ya da sonda herhangi bir hava kabarcığı ortadan kaldırır.
3. Görüntü kan sıcaklığı -40 ° C soğutma çip bir mikroskop CCD kamera ile akış ve yaklaşık 100X toplam çözünürlük (10X mikroskop objektif yani, ve 10X ön kamera göz). Standart Rodamin / TRITC filtre setleri (uyarma 450-490 nm, emisyon> 515 nm) kullanın. Ortaya çıkan görüntü dizilerinin gerçek kare hızı ve piksel çözünürlüğü kaydedin. Yığının başına rekor en az 200 (ideal etrafında 300) görüntüleri, akış hızı başarılı analizini sağlamak.
4. Tuzlu su ip yaklaşık 1 ml her bir saat enjekte edilerek hayvanda sıvı kaybı doldurun.
   NOT: Bir müdahale içeren deneysel ayarları, örneğinBir akciğer kanseri metastazı kan akış hızını değiştiren bir ilaç, pulmoner metastatik kanser kan akış hızı tekrarlanan ölçümler gerektirir. Bu genişletilmiş deneyler için, yeterli sıvı ile hayvan doldurmak için önemlidir.
5. Kuyruk venine 3N KCI 3 ml infüzyon ile hayvanlara Euthanize
6. Tüm kan akışı için akış hızı gri tonlu ve renkli kodlanmış haritalar ^10,11 izleri yaratacak bir yayınlanan kamuya açık Matlab tabanlı bir bilgisayar algoritması kullanarak görüntü yığınlarını değerlendirin. Daha sonra, kan hücrelerinin hiçbir hareket gösterir aktif damarsal yani değerleri kapalı eşikleme sonra, örneğin Görüntü J gibi ticari veya kamuya açık görüntü analiz yazılımı kullanarak ortaya çıkan gri tonlu görüntüleri değerlendirir.

Sonuçlar

Katı tümörlerde damar kıvrımlarında daha fazla derece ve daha yüksek intervasküler mesafeleri ¹³ gösteren normal kan akımının önemli ölçüde farklıdır bilinmektedir. Normal akciğer mikro (Şekil 2A, üst panel) ile karşılaştırıldığında duruma göre, deneysel akciğer, meme kanseri ve sarkom metastazlarında kan akışı parçalar düzensiz şekiller ve geniş intervasküler boşluklar (Şekil 2A, iki alt paneller) sahiptir. Bir önceki çalışmada, ...

Tartışmalar

Bir model İntra vital mikroskopik ve hesaplama kan akışı analizi kullanılarak mikro dolaşım kan akışı ve sıçanların akciğer metastazı Diğer dinamik süreçleri, görüntü değişikliklerine mümkün olduğu gösterilmiştir. Diğer yöntemler kemirgenler açık ribcages maruz akciğerler üzerinde mikroskopi gerçekleştirmek için var iken, bu model aynı zamanda bir kapalı göğüs ortamda bir göğüs duvarı perforasyon ile görüntü pulmoner metastazlar için ilk. Bu yöntemle kullanarak, fizibil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope