زرع الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع في نموذج الفأر

Summary

لتحسين معرفتنا تشكيل neotissue الخلوية والجزيئية، تم تطوير نموذج الفئران من TEVG مؤخرا. تم زرع الطعوم كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. هذا النموذج يحقق نتائج مماثلة لتلك التي تحققت في التحقيق السريرية لدينا، ولكن على مدى تقصير حتى الوقت بالطبع.

Abstract

وغالبا ما تستخدم السقالات المصنفة قابلة للتحلل مع خلايا نخاع العظام وحيدات النوى (خلايا نخاع العظم) لجراحة لعلاج التشوهات الخلقية في القلب. أظهرت النتائج السريرية طويلة المدى في أسعار المباح ممتازة، ولكن، مع انتشار كبير لتضيق. للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية ومنع التنمية تضيق في الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs)، قمنا بتطوير نموذج الفأر من الكسب غير المشروع مع ما يقرب من 1 مم القطر الداخلي. الأولى، تم تجميعها TEVGs من السقالات الأنبوبية القابلة للتحلل ملفقة من محبوكة حمض polyglycolic شعرت شبكة المغلفة مع ε-caprolactone وL-lactide من البوليمرات. والسقالات ثم توضع في مجفاد، بالمكنسة الكهربائية لمدة 24 ساعة، وتخزينها في مجفف حتى بذر الخلية. الثانية، وقد تم جمع نخاع العظم من فئران المانحة وتم عزل الخلايا وحيدات النوى من قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي. الثالث، كان ما يقرب من مليون خليةالمصنفة على السقالة وحضنت O / N. أخيرا، تم السقالات المصنف ثم زرعها كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. أظهرت ترقيع مزروع المباح ممتاز (> 90٪) دون وجود أدلة حدوث مضاعفات الانسداد التجلطي أو تشكيل أمدمي. وهذا نموذج الفئران تساعدنا في فهم وقياس الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue في TEVG.

Introduction

عيوب القلب الخلقية هي الظروف الخطيرة التي تؤثر على ما يقرب من 8٪ من الولادات الحية في الولايات المتحدة. ما يقرب من 25٪ من الرضع الذين يعانون من عيوب خلقية في القلب أو 2.4 لكل 1،000 ولادة حية، تتطلب العلاج الغازية في السنة الأولى من حياتهم ^1. العلاج الأكثر فعالية لأمراض القلب الخلقية هو الجراحة الترميمية. للأسف، والمضاعفات الناجمة عن استخدام القنوات المتاحة حاليا الأوعية الدموية هي السبب الأكثر أهمية للمراضة والوفيات بعد الجراحة.

لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير أول الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs) للاستخدام السريري ^2. شيدت TEVGs من أنابيب البوليستر القابلة للتحلل المصنف مع نخاع العظم ذاتي الخلايا المستمدة من وحيدات النوى (BM-الشركات المتعددة الجنسيات) وزرع كقنوات الوريدي لجراحة القلب الخلقية. أظهرت النتائج معدلات ممتازة في المباح 1-3 سنوات من المتابعة، ولكن مع انتشار كبير من تضيق 3،4. كان من الواضح أن هناك حاجة إلى فهم أفضل لتشكيل neotissue الأوعية الدموية والآلية الكامنة وراء تطوير TEVG تضيق. من أجل فهم أفضل للتنمية TEVGs وآلية التنمية تضيق، تم إنشاء نموذج الأغنام ^5،6. في هذا النموذج، وTEVGs تحولت بنجاح في السفن الذين يعيشون وكانت مشابهة في كل من التشكل وظيفة الأوردة الأصلية. كان هذا الاستخدام نموذج الحيوانات الكبيرة خطوة أولى جيدة في توفير معلومات ما قبل السريرية الهامة التي ساعدت الاستخدام السريري للTEVGs. ومع ذلك، فهم كامل من الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية في TEVGs باستخدام نماذج حيوانية كبيرة محدودة بسبب القيود في التوصيف الجزيئي للخلية الظواهر الأوعية الدموية بسبب نقص أنواع الأدوات الجزيئية محددة. للتغلب على أوجه القصور هذه، تم تطوير نموذج الفئران من TEVGs بسبب التقدم السريع في علم الوراثة والبيولوجيا الماوس الخاصة بهم واسعةص توصيف مع ميزة إضافية تتمثل في مقياس زمني تقصير.

في الفئران IVC نموذج مداخلة لخص بإخلاص عملية neovessel التشكيلة التي تحدث في الحيوانات الكبيرة والبشر، ولكن مع مرور دورة زمنية أقصر بكثير ^6-9. هنا، بروتوكول مفصلة لتصنيع الكسب غير المشروع على نطاق ضيق باستخدام السقالات القابلة للتحلل، وصفت حصاد BM-MNC والعزلة، BM-MNC البذر على السقالة، وزرع الفساد في نموذج الفئران.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة مستشفى المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام البلاد للطفولة.

1. الكسب غير المشروع تصنيع

1. جعل الحل ε-caprolactone وL-lactide كوبوليمر P (LA / CL) وذلك بإضافة 100MG P (LA / CL) في 2 مل ديوكسان تحت غطاء الدخان. وضع الحل على دوامة وخلط مستمر لمدة 1-1.5 ساعة لتذوب تماما.
2. في هذه الأثناء، وإزالة ورقة من حمض polyglycolic (PGA) ورأى من الفريزر وقطع العديد 5 × 8 أقسام ملم. أيضا بقطع غيض من ماصة ميكرولتر ،1-10 فقط فوق تصفية.
3. إدراج 19 G إبرة (1.5 طول) في نهاية البعيدة من طرف الماصة والتفاف شعر PGA حول إبرة باستخدام ملقط الجزئي.
4. دفع بعناية اللباد إلى نهاية البعيدة للطرف الماصة، حيث التجويف هو استقامة من الجزء القريب، وذلك باستخدام إبرة حادة 18 G، في حين يتم إدخال إبرة G 19 في ذلك.
5. ماصة40 ميكرولتر P (CL / LA) حل في تلميح ماصة من أعلى. تشبع PGA شعرت مع الحل. ثم دفع فقاعات الهواء خارج باستخدام موزع ماصة. تكرار هذه العملية إذا لزم الأمر.
6. المكان الطعوم في أنبوب 50 مل ووضعه في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تأكد من أن رئيس الإبر مواجهة الهبوط.
7. نقل أنبوب إلى مجفاد وفراغ لمدة 24 ساعة. تأكد من فتح غطاء أنبوب أن يكون تدفق الهواء.
8. اخراج الطعوم وإزالتها من الإبر. قطع طرفي الكسب غير المشروع ترك ملم القسم ~ 5 ووضعها مرة أخرى على الإبر للحفاظ على شكلها. إبقاء الطعوم في مجفف.
9. وضع السقالة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجال السلامة الأحيائية هود O / N قبل البذر الخلية.

2. نخاع العظم وحيدات النوى حصاد الخليوي والعزلة

1. الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 200 ملغ / كغ وزيلازين، 20 ملغ / كلغ).
2. إزالة العظام (عظام الفخذ ود tibias) من 3 الفئران لمدة 10 زرع الكسب غير المشروع ووضعه في طبق بتري مع 10 سم مكعب RPMI. قطع طرفي العظام ونخاع العظام دافق باستخدام حقنة مع إبرة G 25 في طبق بتري جديدة مع 3 سم مكعب RPMI. جمع نخاع العظام وحل RPMI في 15 سم مكعب وأنبوب غسل طبق بتري مع إضافية RPMI 2 سم مكعب لجمع ما تبقى من BM.
3. تأخذ عينة (5-10 ميكرولتر) وعدد الخلايا باستخدام خلية مكافحة الآلي أو عدادة الكريات. سجل النتيجة.
4. وضع 5 سم مكعب Ficoll في أنبوب الطرد المركزي 15 سم مكعب وإضافة نخاع العظم وحل RPMI. إضافة الحل بلطف شديد لمنعها من الاختلاط مع Ficoll.
5. أجهزة الطرد المركزي في 528 x ج لمدة 30 دقيقة مع "NO الفرامل" في 24 درجة مئوية.
6. إزالة الطبقة العليا وردي. جمع الوسط واضحة طبقة الشكل 1، والتي هي طبقة MNC، وتمييع مع PBS 1:1.
7. أجهزة الطرد المركزي في محلول مخفف MNC في 528 x ج لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية.
8. إزالة طاف وديالعود بيليه مع 5 مل PBS.
9. أجهزة الطرد المركزي في حل بيليه في 528 x ج لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية.
10. إزالة طاف. تمييع بيليه مع حجم مناسب من RPMI (~ 200 ميكرولتر).
11. أخذ عينة ميكرولتر 5-10 وتعول الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي أو عدادة الكريات. سجل النتيجة. تكرار الخلية عد واحد مزيد من الوقت وحساب متوسط ​​عدد الخلايا.
12. تمييع تركيز الخلية إلى 1،000،000 cells/10 ميكرولتر باستخدام RPMI.

3. البذر الخليوي

1. سقالة Prewet بإضافة 5 ميكرولتر RPMI luminally لمدة 5 دقائق، ثم إزالة RPMI.
2. إضافة 10 ميكرولتر نخاع العظام المستمدة الخلايا أحادية النووية في RPMI من الخطوة 2.12 إلى التجويف السقالة والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على السقالة.
3. خفض إبرة 19 G إلى 1 سم طول ووضع الإبرة في التجويف من السقالة للحفاظ على شكل السقالة. وضع العينة في 24 لوحة جيدا.
4. إضافة ميكرولتر 1،000 RPMI إلى كل بئر واحتضان O / N في حاضنة.

4. زرع الكسب غير المشروع

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة: 1x أخرى مقص غرامة، وملقط الدقيقة 3X، والمشابك الأوعية الدموية الصغيرة 2X، 1X المشبك ملقط تطبيق، 1x أداة حامل الإبرة الصغيرة، مقص الربيع 1X، 1X ضام.
2. 6-8 أسابيع من العمر الإناث تستخدم C57BL / 6 كما الأنسجة المهندسة المتلقين الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. إزالة الماوس من قفصه وتزن عليه، ثم تخدير عن طريق حقن داخل الصفاق في الربع السفلي الأيمن من البطن مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 100 ملغ / كغ وزيلازين، 10 ملغ / كلغ). يستخدم كيتوبروفين (5 ملغ / كغ، IP) كمسكن ما قبل التخدير.
3. فحص مستوى التخدير بواسطة معسر حكاية، ثم مقطع الشعر في البطن. تليين العينين مع مرهم للعين معقمة، ووضع الماوس في وضع رقود ظهري على وسادة. تطهير البطن مع بتدين والكحول منصات. شاركVER الماوس مع ثنى العقيمة وفضح منطقة شق فقط.
4. جعل خط الوسط شق البطن من تحت سيفي الشكل إلى منطقة فوق العانة، وإدراج ضام الذاتي الاحتفاظ. التفاف الأمعاء في المياه المالحة الشاش المبلل. تحدد بصراحة الشريان الأورطي infrarenal والوريد الأجوف.
5. وضع اثنين من المشابك الأوعية الدموية الصغيرة على حد سواء القريبة والبعيدة الجانبين من الشريان الأبهر والوريد الأجوف ثم فصل بصراحة الشريان الأورطي من الوريد الأجوف إقطع الوريد الأجوف. إذا لزم الأمر، ligate فروع الأبهر البطني مع 10-0 الغرز حيدة على الإبر مدبب.
6. زرع على الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع مع نهاية الداني القاصي وإنهاء anastomoses باستخدام العقيمة 10-0 خياطة. تقليم الكسب غير المشروع، عادة 1-2 مم، يعتمد على التشريح من الفأرة. تأمين الكسب غير المشروع مع غرزة واحدة على كلا طرفي القاصي والداني والبدء في خياطة باستمرار مع 4-5 غرز من الجانب الآخر من الكسب غير المشروع. بعد الانتهاء من الجانب الأمامي، والوجه المشابك والطعومإلى الجانب الآخر وخياطة الجانب الخلفي من الكسب غير المشروع. خلال زرع، تدفق الكسب غير المشروع مع الحل الهيبارين في كثير من الأحيان لمنع تجلط الدم الحاد.
7. إزالة المشبك الداني والسيطرة على النزيف من خلال تطبيق موضعي للامتصاص وكيل مرقئ العقيمة. عندما يتوقف النزيف تماما، وإزالة المشبك القاصي والسيطرة على النزيف بنفس الطريقة. جعل تدفقات الدم تأكد من خلال الكسب غير المشروع.
8. إغلاق عضلات البطن والجلد في طبقتين باستخدام مادة البولي أميد 6-0 سوداء خياطة حيدة مع إبرة شملت مترابطة.
9. حقن 0.5 مل تحت الجلد المالحة ووضع الماوس في قفص الانتعاش على وسادة الاحترار حتى الماوس النقالة بشكل كامل. بعد شفائهم، والعودة الماوس لقفص جديد مع الفراش ورقة. إعطاء مسكنات للألم (ايبوبروفين، 30 مغ / كغ، ومياه الشرب) لمدة 48 ساعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد التخطيطي TEVG غرس في الشكل 1. كان حصادها نخاع العظم من الماوس المانحة وتم عزل الخلايا أحادية النووي باستخدام كثافة الطرد المركزي ثم المصنف على سقالة قابلة للتحلل. حضنت السقالات المصنفة O / N وزرعها لماوس المتلقي باعتبارها الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نموذج الفأر من TEVG هو أداة قيمة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue وتطوير تضيق. وقد أظهرت المصنف BM-MNC في كل من الصور النسيجية ووزارة شؤون المرأة من الخلايا المصنفة على الكسب غير المشروع ^11. وقد أظهرت كفاءة البذر الخلية أيضا باستخدام فحص الحمض النووي ^7...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500