下腔静脉间置移植物在小鼠模型中植入

摘要

为了提高我们的细胞和分子neotissue形成的知识，最近被开发的TEVG小鼠模型。移植物植入在C57BL / 6小鼠肾下腔静脉移植物插入。该模型能达到类似的结果那些在我们的临床调查来实现，但在一个远缩短时间过程。

摘要

接种骨髓单个核细胞（骨髓细胞）生物可降解支架通常用于重建手术治疗先天性心脏畸形。长期的临床结果显示出优异的通畅率，但是，与狭窄的显著发病率。为了探讨血管neotissue形成的细胞和分子机制，防止狭窄发展组织工程血管移植（TEVGs），我们制定了移植物的小鼠模型大约1毫米的直径。首先，TEVGs被从聚乙醇酸无纺布制成可生物降解的管状支架组装毡网眼涂有ε-己内酯和L-丙交酯共聚物。的支架，然后放置于冷冻干燥机，抽真空24小时，并在干燥器中储存直到细胞接种。第二，骨髓是从供体小鼠中收集和单核细胞中分离出密度梯度离心。第三，约百万细胞接种于支架培养的O / N。最后，将种子支架，然后注入在C57BL / 6小鼠肾下腔静脉移植物插入。植入移植物表现出良好的通畅性（> 90％），无血栓栓塞并发症或动脉瘤形成的证据。这种小鼠模型将有助于我们理解和量化neotissue形成的TEVG的细胞和分子机制。

引言

先天性心脏缺陷是影响近8％的活产婴儿在美国的严重情况。约25％的婴儿患有先天性心脏缺陷或2.4每1000活产的，需要侵入性治疗在他们的生活¹的第一年。最有效的治疗先天性心脏疾病是重建手术。不幸的是，从使用目前可用的血管导管引起的并发症是术后发病率和死亡率的最显著的原因。

为了解决这个问题，我们开发了第一个组织工程血管移植（TEVGs）的临床应用^2。 TEVGs从播种与自体骨髓单个核细胞（BM-跨国公司），并作为植入静脉导管先天性心脏手术的可生物降解聚酯管构成。结果表明，优秀的通畅率在1-3年的随访，但狭窄的发生率显著 3,4。很明显，是需要更好地了解血管neotissue形成及相关TEVG狭窄的发展机制。为了更好地了解TEVGs的发展和狭窄发展的机制，一个绵羊模型建立^5,6。在这个模型中，TEVGs成功转型为生活器皿并分别在这两个形态和原生矿脉的功能类似。这种使用了大量的动物模型是在提供辅助TEVGs的临床应用重要的临床前信息的一个很好的第一步。然而，血管neotissue形成用大动物模型TEVGs的细胞和分子机制的充分了解是由于由于缺乏物种特异的分子工具的血管细胞表型的分子特征局限性的限制。为了克服这些缺点，TEVGs小鼠模型是由原因的迅速发展在小鼠遗传学和其广泛的molecula的研制Ř表征具有缩短的时间刻度的额外优势。

鼠下腔静脉插入模型忠....

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研究方案

注：所有动物的程序批准了全国儿童医院实验动物管理和使用委员会。

1，嫁接制造

1. 通过在通风橱中加入100毫克P（LA / CL）在2毫升二氧杂环己烷使ε-己内酯和L-丙交酯共聚物P（LA / CL）的溶液。将解决方案在涡不断为1-1.5小时至完全溶解混匀。
2. 在此期间，除去聚乙醇酸片材（PGA），从冷冻库毡和切出几个5毫米x 8毫米的部分。也切断0.1-10微升移液器只是过滤器上方的一角。
3. 插入19号针头（1.5长度）成吸管尖的前端和包裹在PGA毡针周围采用微型镊子。
4. 小心地将毛毡的吸管头，其中所述管腔是比近侧部分直，用钝18号针头的前端，而19号针头插入它。
5. 移液器40微升P（CL / LA）的溶液成从顶部枪头。饱和PGA毡用的解决方案。然后用移液管分配器推气泡出来。 如果需要，重复此过程。
6. 在50毫升试管移植地点，并将其放置在-80℃下冷冻20分钟。确保针的头部朝下。
7. 传输管放入冻干机及真空24小时。请务必打开管盖有气流。
8. 取出移植物，并从针头中删除。剪下移植留下了约5 mm截面的两端，把他们放回针来保持其形状。保持在干燥器的移植。
9. 在生物安全罩O / N前细胞种植放置支架在紫外光下。

2，骨髓单核细胞收获和隔离<....

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结果

的TEVG植入的示意图示于图1。骨髓被从供体小鼠收获并用密度离心的单核细胞中分离出，然后接种到生物可降解的支架。该种子支架培养的O / N和植入到受体小鼠为下腔静脉介入移植。

图2示出了PGA-P（CL / LA）支架材料的扫描电子显微镜。内部直径约为1毫米的壁厚为约0.17毫米。总孔隙度为78.5％，平均孔径分别为45.4±17.6微米。

插?.......

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讨论

TEVG的小鼠模型是研究细胞和分子neotissue形成和狭窄的发展机制的重要工具。引晶的BM-MNC中所示的移植物¹¹的种子细胞的两个组织学和SEM图像。细胞接种效率是利用DNA测定⁷还示出。利用该模型系统中，我们发现，细胞接种降低TEVG狭窄，这是失败的主模式在我们的人体临床试验³的发展的发生率。将接种的细胞迅速从TEVG消失，这表明它们通过旁分泌机制^8,12发挥它们?.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500