Die Implantation von Vena Cava Interposition Graft in Maus-Modell

Zusammenfassung

Nach unserer Kenntnis der zellulären und molekularen neotissue Bildung zu verbessern, wurde ein Maus-Modell der TEVG vor kurzem entwickelt. Die Transplantate wurden als infrarenalen Vena cava Zwischen Transplantate in C57BL / 6 Mäusen implantiert. Dieses Modell erzielt ähnliche Ergebnisse wie in unserer klinischen Untersuchung erreicht wird, sondern über einen weit verkürzt Zeitverlauf.

Zusammenfassung

Biologisch abbaubare Gerüste mit Knochenmark-mononuklearen Zellen (BMC) ausgesät werden oft für die rekonstruktive Chirurgie verwendet werden, um angeborene Herzfehler zu behandeln. Die langfristigen klinischen Ergebnisse zeigten ausgezeichnete Offenheitsrate, jedoch mit erheblichen Inzidenz von Stenose. Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Gefäß neotissue Bildung zu untersuchen und zu verhindern Stenose Entwicklung in Gewebezüchtungen Gefäßprothesen (TEVGs), ein Mausmodell des Transplantats entwickelten wir mit ca. 1 mm Innendurchmesser. Zunächst wurden die TEVGs aus biologisch abbaubaren Rohrgerüste aus einer Polyglykolsäure Vlies hergestellt gebaut Filz kämmen mit ε-Caprolacton und L-Lactid-Copolymer beschichtet. Die Gerüste wurden dann in einem Gefriertrockner angeordnet ist, für 24 h abgesaugt und im Exsikkator bis zur Zellbesiedelung gespeichert. Zweitens, wurde Knochenmark aus Spendermäusen gesammelt und mononukleäre Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Drittens waren etwa eine Million Zellenauf einem Gerüst ausgesät und inkubiert O / N. Schließlich wurden die beimpften Scaffolds dann als infrarenalen Vena cava Zwischen Transplantate in C57BL / 6 Mäusen implantiert. Die implantierten Grafts zeigten hervorragende Durchgängigkeit (> 90%) ohne Nachweis von thromboembolischen Komplikationen oder Aneurysmabildung. Dieses Mausmodell wird uns beim Verständnis und bei der Quantifizierung der zellulären und molekularen Mechanismen der neotissue Bildung in der TEVG.

Einleitung

Angeborene Herzfehler sind schwere Erkrankungen, die fast 8% der Lebendgeburten in den Vereinigten Staaten zu beeinflussen. Etwa 25% der Kinder mit angeborenen Herzfehlern oder 2,4 pro 1.000 Lebendgeburten, erfordern invasive Behandlung im ersten Jahr ihres Lebens ^ein. Die wirksamste Behandlung für angeborene Herzkrankheit ist die rekonstruktive Chirurgie. Leider Komplikationen, die aus der Verwendung von gegenwärtig verfügbaren Gefäßleitungen sind die häufigste Ursache von postoperativen Morbidität und Mortalität.

Um dieses Problem anzugehen, für den klinischen Einsatz entwickelt ² haben wir die ersten Gewebezüchtungen Gefäßprothesen (TEVGs). TEVGs wurden aus biologisch abbaubaren Polyesterrohre mit autologen Knochenmark-mononuklearen Zellen (BM-MNU) ausgesät und wie venösen Leitungen für angeborene Herzchirurgie implantiert errichtet. Die Ergebnisse zeigten eine ausgezeichnete Offenheitsrate bei 1-3 Jahren Follow-up, aber mit bedeutenden Vorkommen von Stenosen 3,4. Es war klar, dass ein besseres Verständnis der vaskulären neotissue Bildung und der Mechanismus der Entwicklung der zugrunde liegenden Stenose TEVG benötigt wurde. Um die Entwicklung der TEVGs und den Mechanismus der Stenose Entwicklung besser zu verstehen, wurde ein Schaf-Modell ^5,6 erstellt. In diesem Modell werden die TEVGs erfolgreich in die Wohnschiffe umgewandelt und waren in beiden Morphologie und Funktion des nativen Adern. Diese Verwendung von Großtiermodell war ein guter erster Schritt, um wichtige präklinische Informationen, die klinische Nutzung von TEVGs unterstützt. Jedoch volles Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der Gefäßbildung in neotissue TEVGs mit Großtiermodell aufgrund von Einschränkungen in die molekulare Charakterisierung der Gefäßzell Phänotypen aufgrund des Fehlens von speziesspezifischen molekularen Werkzeugen begrenzt. Um diese Nachteile zu überwinden, wurde ein Mausmodell der TEVGs wegen des rasanten Fortschritt in der Mausgenetik und ihre umfangreiche molecula entwickeltr Charakterisierung mit dem zusätzlichen Vorteil eines verkürzten Zeitskala.

Die murine IVC Zwischenmodell treu rekapituliert den Prozess der Bildung neovessel, die in großen Tieren und Menschen auftritt, sondern über einen viel kürzeren Zeitverlauf ^9.6. Hier wird ein detailliertes Protokoll für kleine Fertigungs Transplantat mit biologisch abbaubaren Gerüste, BM-MNC Ernte und Isolation, BM-MNC Aussaat auf Gerüst und Graft-Implantation in einem Mausmodell beschrieben wurden.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden von der Nationwide Kinderkrankenhaus Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Graft Fertigungs

1. Machen Sie das ε-Caprolacton und L-Lactid-Copolymer P (LA / CL) Lösung durch Zugabe von 100 mg P (LA / CL) in 2 ml Dioxan unter einer Abzugshaube. Legen Sie die Lösung auf einem Vortex mischen und kontinuierlich für 1-1,5 Stunden vollständig auflösen.
2. In der Zwischenzeit, entfernen Sie ein Blatt Polyglykolsäure (PGA) fühlte sich aus dem Gefrierschrank und schneiden Sie mehrere 5 x 8 mm Abschnitte. Auch die Spitze eines 0,1-10 ul Pipette knapp über dem Filter abgeschnitten.
3. Legen Sie eine 19 G-Nadel (1,5 Länge) in das distale Ende einer Pipettenspitze und wickeln die PGA mit Mikro Pinzette gefühlt rund um die Nadel.
4. Drücken Sie vorsichtig den Filz zum distalen Ende der Pipettenspitze, wo das Lumen gerader als im proximalen Teil, mit einer stumpfen Nadel 18 G, 19 G, während die Nadel in sie eingefügt.
5. Pipette40 ul P (CL / LA)-Lösung in die Pipettenspitze von der Spitze. Tränken Sie den PGA fühlte mit der Lösung. Dann drücken Sie Luftblasen aus mit einer Pipette Dispenser. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn nötig.
6. Platz Transplantate in einem 50-ml-Tube und legen Sie sie in einem -80 ° C Gefrierschrank für 20 min. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Nadeln nach unten weisen.
7. Übertragen Sie das Rohr in einen Gefriertrockner und Vakuum für 24 Stunden. Achten Sie darauf, den Deckel der Röhre zu öffnen, um Luftzirkulation zu haben.
8. Nehmen Sie die Transplantate und entfernen Sie sie von den Nadeln. Schneiden Sie die beiden Enden des Transplantats Verlassen eines ~ 5 mm Abschnitt und setzte sie wieder auf die Nadeln, um ihre Form zu halten. Halten Sie die Transplantate in einem Exsikkator.
9. Legen Sie das Gerüst unter UV-Licht in einem biologischen Sicherheitshaube O / N vor der Zellaussaat.

2. Knochenmark mononukleären Zellernte und Isolation

1. Euthanize die Mäuse mit Ketamin / Xylazin Dosierung (Ketamin 200 mg / kg und Xylazin, 20 mg / kg).
2. Entfernen Knochen (Oberschenkelknochen eind Schienbeinknochen) von 3 Mäusen für 10 Graft-Implantationen und in eine Petrischale mit 10 ccm RPMI. Schneiden beide Enden der Knochen und Knochenmark bündig mit einer Spritze mit einer 25 G-Nadel in eine neue Petrischale mit 3 ml RPMI. Sammeln Knochenmark und RPMI-Lösung in einem 15 ccm Rohr und waschen Sie die Petrischale mit zusätzlichen 2 ccm RPMI um den Rest der BM zu sammeln.
3. Nehmen Probe (5-10 ul) und zählen Zelle mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler oder Hämozytometers. Notieren Sie das Ergebnis.
4. Setzen Sie 5 ccm Ficoll in einem 15 ccm-Zentrifugenröhrchen und fügen Knochenmark und RPMI Lösung. Fügen Sie die Lösung ganz sanft, um es von dem Mischen mit Ficoll verhindern.
5. Zentrifugieren bei 528 g für 30 min mit "NO BRAKE" bei 24 ° C
6. Entfernen Sie die obere Schicht rosa. Sammeln Sie die Mitte klare Schicht 1, die die MNC-Schicht und verdünnen Sie es mit PBS 01.01.
7. Zentrifugieren der verdünnten Lösung bei MNC 528 × g für 10 min bei 24 ° C.
8. Entfernen Sie den Überstand und diLaute das Pellet mit 5 ml PBS.
9. Zentrifugieren Sie das Pellet-Lösung bei 528 × g für 10 min bei 24 ° C.
10. Entfernen Sie den Überstand. Verdünnen Sie die Pellets mit dem entsprechenden Volumen RPMI (~ 200 ul).
11. Werfen Sie einen 5-10 ul Probe und zählen Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler oder Hämozytometers. Notieren Sie das Ergebnis. Wiederholen Sie den Zellzählung ein weiteres Mal und berechnen die durchschnittliche Zellzahl.
12. Verdünnen Zellkonzentration zu 1.000.000 Zellen/10 ul RPMI mit.

3. Zellaussaat

1. Prewet Gerüst durch Zugabe von 5 ul RPMI luminal für 5 Minuten, dann entfernen RPMI.
2. In 10 ul Knochenmark stammMonoNuklearZellen in RPMI aus Schritt 2.12 bis Gerüst Lumen und 10 Minuten warten, damit Zellen auf dem Gerüst zu befestigen.
3. Schneiden Sie ein 19 G-Nadel zu 1 cm Länge und legte die Nadel in das Lumen des Gerüst, um die Form des Gerüsts zu halten. Legen Sie die Probe in einer 24-Well-Platte.
4. In 1000 ul RPMI in jede Vertiefung und Inkubation O / N in einem Inkubator.

4. Graft-Implantation

1. Autoklav alle chirurgischen Werkzeugen vor der Operation: 1x feinen Schere, 3x Mikropinzette, 2x Mikrogefäßklemmen, 1x Klemmanlegezange, 1x Mikro-Nadelhalter, 1x Feder Schere, 1x Aufroller.
2. 6-8 Wochen alte weibliche C57BL / 6 als Gewebezüchtungen Gefäßtransplantat-Empfänger verwendet. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und gewogen, dann durch eine intraperitoneale Injektion betäuben in der rechten unteren Quadranten des Bauches mit einer Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin 100 mg / kg Xylazin und 10 mg / kg). Ketoprofen (5 mg / kg, IP) als Pre-Anästhesie Analgetikum.
3. Überprüfen Sie die Höhe der Sedierung durch Einklemmen Geschichte, klemmen Sie dann das Bauch Haar. Schmieren Sie die Augen mit einer sterilen Augensalbe, und legen Sie die Maus in einem dorsalen recumbence Position auf einer Unterlage. Desinfizieren Sie den Bauch mit Betadine und Alkohol-Pads. Cover die Maus mit einem sterilen Tuch und setzen nur die Schnittbereich.
4. Machen Sie eine Mittellinie Laparotomieschnitts von unterhalb des Schwertfortsatz an der suprapubischen Region, und legen Sie eine Wundspreizer. Wickeln Sie den Darm in Kochsalzlösung befeuchtet Gaze. Unverblümt definieren die infrarenale Aorta und Vena Cava.
5. Legen Sie zwei Mikrogefäßklemmen auf beiden proximalen und distalen Seiten der Aorta und Vena Cava dann unverblümt trennen die Aorta von der Vena Cava Transect der Vena Cava. Wenn nötig, ligieren die Bauch-Aorten-Filialen mit einem 10-0 Monofilamentnahtmaterialien auf verjüngten Nadeln.
6. Implantieren eine untere Hohlvene Zwischen Transplantat mit proximalen und distalen Ende Anastomosen mit einem sterilen Naht 10-0 beenden. Schneiden Sie das Transplantat, in der Regel 1-2 mm, abhängig von der Anatomie der Maus. Sichern Sie das Transplantat mit einer Masche auf beiden proximalen und distalen Ende und beginnen, kontinuierlich mit 4-5 Stichen von der anderen Seite des Transplantats zu nähen. Nach Abschluss der Frontseite, drehen Sie die Klemmen und Transplantateauf die andere Seite und die Naht der Rückseite des Transplantats. Während der Implantation, spülen Sie das Transplantat mit Heparin-Lösung häufig zu akuten Thrombose zu verhindern.
7. Entfernen Sie die proximale Klemme und die Blutung steuern, indem eine topische sterile resorbierbare Gefäßklemme Mittel. Wenn die Blutung vollständig stoppt, entfernen Sie den distalen Klemme und die Kontrolle der Blutung die gleiche Weise. Stellen Sie sicher, Blut fließt durch die Prothese.
8. Schließen Sie die Bauchmuskulatur und die Haut in zwei Schichten mit einem 6-0 schwarzem Polyamid Monofilamentnahtmaterial mit einbezogen Gewinde Nadel.
9. Spritzen Sie 0,5 ml Kochsalzlösung subkutan und legen Sie die Maus in einem Käfig auf einer Recovery-Erwärmung bis die Maus-Pad ist voll mobil. Nach Wiederaufnahme, kehren Sie die Maus auf einen neuen Käfig mit Papier Betten. Geben Sie Schmerzmittel (Ibuprofen, 30 mg / kg, Trinkwasser) für 48 Stunden.

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Ergebnisse

Eine schematische Darstellung TEVG Implantation ist in Fig. 1 gezeigt. Knochenmark wurde von einem Spender Maus geerntet und Mononuklearzellen wurden mittels Dichtezentrifugation isoliert und ausgesät auf einem biologisch abbaubaren Gerüst dann. Die Gerüste wurden entkernt inkubiert O / N und an eine Empfängermaus als untere Hohlvene Zwischen Graft implantiert.

Figur 2 zeigt die Rasterelektronenmikroskopie des PGA-P (CL / LA) Gerüst. Der Innendurchmesse...

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Diskussion

Das Mausmodell der TEVG ist ein wertvolles Werkzeug, um zelluläre und molekulare Mechanismen der neotissue Bildung und der Entwicklung der Stenose zu studieren. Die beimpften BM-MNC wurde in beiden histologischen und SEM-Bilder der beimpften Zellen auf dem Transplantat ¹¹ gezeigt. Zellansiedlungseffizienz wurde auch unter Verwendung eines DNA-Assay ⁷ gezeigt. Mit diesem Modellsystem haben wir gezeigt, dass Zellaussaat verringert die Häufigkeit der Entwicklung der TEVG Stenose, die die primäre Fo...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500