Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu

Özet

Hücresel ve moleküler neotissue oluşumu hakkındaki bilgi geliştirmek için, TEVG bir fare modeli yakın zamanda geliştirilmiştir. Greftler C57BL / 6 farelerinde Infrarenal vena kava araya girme greft olarak implante edildi. Bu model bizim klinik araştırmada elde edilenlere benzer sonuçlar elde, ama çok kısaltılmış zaman zarfında.

Özet

Kemik iliği mononükleer hücreler (BMCS) ile ekildi biyobozunur iskelelerinin genellikle doğumsal kalp anomalileri tedavi rekonstrüktif cerrahi için kullanılır. Uzun süreli klinik sonuçları darlık önemli insidans, ancak mükemmel açıklık oranları gösterdi. Vasküler neotissue oluşumu hücresel ve moleküler mekanizmalarının araştırılması ve doku mühendisliği damar grefti (TEVGs) içinde darlık gelişimini önlemek için, biz yaklaşık 1 mm iç çapı ile greft bir fare modeli geliştirdi. İlk olarak, TEVGs bir poliglikolik asit dokunmamış imal edilmiş biyolojik olarak parçalanabilir boru şekilli iskeleler monte edilmiştir ε-kaprolakton ve L-laktid kopolimeri ile kaplanmış ağ hissetti. Iskeleler, daha sonra bir dondurarak kurutucuda yerleştirilen 24 saat boyunca vakumlu ve hücre tohumlama kadar bir desikatör içinde depolanmıştır. İkinci olarak, kemik iliği donör farelerden toplandı ve tek çekirdekli hücreler yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole edilmiştir. Üçüncü olarak, yaklaşık bir milyon hücre idibir yapı iskeleti üzerine ekildi ve O / N inkübe Son olarak, tohumlanmış iskeleler sonra C57BL / 6 farelerinde Infrarenal vena kava araya girme greft olarak implante edildi. Implante greftler tromboembolik komplikasyonlar veya anevrizmal oluşum kanıt olmadan mükemmel açıklık (>% 90) gösterdi. Bu fare modeli anlayış bize yardım ve TEVG içinde neotissue oluşumu hücresel ve moleküler mekanizmaları miktarının olacaktır.

Giriş

Konjenital kalp kusurları ABD'de canlı doğumların yaklaşık% 8 etkileyen ciddi durumlardır. Konjenital kalp kusurları veya 2.4 1.000 canlı doğum olan bebeklerin yaklaşık% 25'i, hayatlarının ¹ ilk yıl invaziv tedavi gerektirir. Konjenital kalp hastalığı için en etkili tedavi rekonstrüktif cerrahi olduğunu. Ne yazık ki, mevcut vasküler kanalların kullanımından kaynaklanan komplikasyonlar ameliyat sonrası morbidite ve mortalitenin en önemli nedenidir.

Bu sorunu çözmek için, klinik kullanım ² için ilk doku mühendisliği vasküler greft (TEVGs) geliştirdi. TEVGs otolog kemik iliğinden elde edilmiş tek-çekirdekli hücreleri (BM-MNC) ile tohumlandı ve konjenital kalp ameliyatı venöz kanalları olarak implante edilen biyolojik olarak parçalanabilir polyester tüplerden inşa edilmiştir. Sonuçlar takipte 1-3 yıldır mükemmel açıklık oranları gösterdi, ama darlığının önemli insidansı 3,4 kadar. Bu vasküler neotissue oluşumu ve TEVG darlık gelişimini altında yatan mekanizmanın daha iyi anlaşılması gerektiği açıktı. Daha TEVGs gelişimini ve darlık gelişme mekanizmasını anlamak için, bir koyun bir model ^5,6 oluşturuldu. Bu modelde, TEVGs başarılı bir şekilde canlı damarları içine transforme edildi ve morfolojisi ve ana damarlar fonksiyonu hem de benzerdi. Büyük bir hayvan modelinin bu kullanımı TEVGs klinik kullanımını destekli önemli klinik öncesi bilgi veren iyi bir ilk adım oldu. Ancak, büyük hayvan modelleri kullanılarak TEVGs vasküler neotissue oluşumu hücresel ve moleküler mekanizmaları tam anlaşılması nedeniyle türlerin spesifik moleküler araçlar eksikliği nedeniyle vasküler hücre fenotipleri moleküler karakterizasyonu kısıtlamalar sınırlıdır. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, TEVGs bir murin modeli fare genetik hızlı ilerleme ve geniş Molecula nedeni ile geliştirilmiştirdaha kısa bir zaman ölçek ilave avantajı ile r karakterizasyonu.

Sıçangil modeli IVC araya girme sadık büyük hayvanlarda ve insanlarda meydana neoveseller oluşum sürecini değinmeyecek ama çok daha kısa bir zaman süreci boyunca ^6-9. Burada, biyolojik olarak parçalanabilir yapı iskelesi kullanılarak küçük ölçekli aşı üretimi için ayrıntılı bir protokol, BM-MNC hasat ve izolasyon, bir platform üzerinde BM-MNC tohumlama ve bir murin modelinde greft tarif edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bütün hayvan prosedürleri Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1.. Greft İmalat

1. Bir davlumbaz altında 2 ml dioksan içerisinde 100 mg P (LA / CL) eklenerek ε-kaprolakton ve L-laktid kopolimeri P (LA / CL) çözeltisi olun. Bir girdap çözüm yerleştirin ve tamamen erimesi için 1-1.5 saat boyunca sürekli olarak karıştırınız.
2. Bu arada, (PGA) dondurucu hissettim poliglikolik asit tabakasını kaldırmak ve birkaç 5 x 8 mm bölümleri kesip. Ayrıca sadece filtrenin üstünde bir 0.1-10 ul pipet ucu kesilmiş.
3. Bir pipet ucunun uzak ucunda bir 19 G iğne (1.5 uzunluk) takın ve PGA mikro forseps kullanılarak iğnenin keçe sarın.
4. 19 G iğne içine takıldığında ise dikkatlice, lümen bir kör 18 G iğne kullanılarak, yakın kısmı daha düz bir pipet ucu, distal ucuna keçeyi itin.
5. Pipet40 ul P (CL / LA) üst ucu içine pipet çözeltisi. PGA çözümü ile hissetti doyurabilecek. Sonra pipet dağıtıcı kullanarak hava kabarcıkları dışarı itmek. Gerekirse bu işlemi tekrarlayın.
6. Yer, 50 ml bir tüp içinde greft ve 20 dakika boyunca -80 ° C dondurucu içine yerleştirin. Iğnelerin baş aşağı doğru karşı karşıya olduğundan emin olun.
7. Bir liyofilizerde içine tüp transferi ve 24 saat için vakum. Hava akımı oluşturacak şekilde tüpün kapağını açmak için emin olun.
8. Greft dışarı atın ve iğnelerden çıkarın. A ~ 5 mm bölümünü terkeden greft iki ucunu kesme ve şeklini korumak için, iğnelerin üzerine geri koyun. Desikatörde greft tutun.
9. Bir biyogüvenlik kaput O / N önce hücre tohumlama UV ışık altında iskele yerleştirin.

2.. Kemik İliği Mononükleer Hücre Hasat ve İzolasyon

1. Ketamin / ksilazin aşırı dozda (ketamin 200 mg / kg ketamin hidroklorid ve 20 mg / kg) ile fareler Euthanize.
2. Kaldır kemikler (femur bir10 cc RPMI sahip bir Petri kabındaki 10 greft implantasyonu ve yer 3 fareden d tibias). 3 cc RPMI ile yeni bir Petri kabı, bir 25 G iğnesi olan bir şırınga kullanılarak, kemik ve kemik iliği gömme iki ucunu kesin. 15 cc tüpte kemik iliği ve RPMI çözeltisi toplayın ve BM arasında kalan toplamak için ek 2 cc RPMI ile petri yıkayın.
3. Örnek (5-10 ul) alın ve bir otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre kullanarak hücre saymak. Sonucu kaydedin.
4. 15 cc santrifüj tüpüne 5 cc Ficoll koyun ve kemik iliği ve RPMI çözüm ekleyin. Ficoll'ün ile karıştırma önlemek için çok nazikçe çözüm ekleyin.
5. 24 ° C'de "HAYIR FRENİ" ile 30 dakika boyunca 528 x g'de santrifüj
6. Üst pembe katmanı kaldırın. MNC katmanı orta berrak tabaka Şekil 1, toplayın, ve PBS 01:01 ile sulandırmak.
7. 24 ° C'de 10 dakika boyunca 528 x g'de santrifüj solüsyonu inceltilmiş MNC
8. Süpernatantı ve di kaldırud 5 ml PBS ile pelet.
9. 24 ° C'de 10 dakika boyunca 528 x g'de topak çözeltisi santrifüj
10. Süpernatant kaldırmak. RPMI (~ 200 ul) uygun miktarda pelet seyreltin.
11. 5-10 ul örnek almak ve bir otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Sonucu kaydedin. Bir kez daha sayım hücreyi tekrarlayın ve ortalama hücre sayısını hesaplamak.
12. RPMI kullanarak ul 1.000.000 cells/10 hücre konsantrasyonu sulandırmak.

3.. Hücre Serpilmesi

1. 5 dakika boyunca luminally 5 ul RPMI ilave edilerek ön ıslatılmış iskele, sonra RPMI çıkarın.
2. Iskele lümen Adım 2.12 RPMI 10 ul kemik iliğinden elde edilen mono nükleer hücreleri ekleyin ve 10 dakika hücreleri iskele üzerine takmak için izin için bekleyin.
3. 1 cm uzunluğunda bir 19 G iğne Kesme ve iskele şeklini korumak için, skafoldun lümeni içine iğne koydu. Bir 24-çukurlu plaka içindeki örnek yerleştirin.
4. Her kuyuya 1.000 ul RPMI ilave edin ve bir kuluçka makinesi içinde O / N inkübe edin.

4. Greft İmplantasyonu

1. Ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler otoklava sokun: ince makas, 3x mikro forseps, 2x mikro vasküler kelepçeler, 1x kelepçe uygulayarak forseps, 1x mikro iğne tutucu, 1x yaylı makas, 1x ekartörünü 1x.
2. 6-8 haftalık dişi C57BL / 6 doku mühendisliği damar grefti alıcı olarak kullanılır. Kafesinden fare çıkarın ve ağırlık, daha sonra bir ketamin / ksilazin kokteyl (ketamin 100 mg / kg ketamin hidroklorid ve 10 mg / kg) ile karnın alt sağ çeyrek dairesi içine bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezi. Ketoprofen (5 mg / kg, IP) bir ön anestezi analjezik olarak kullanılır.
3. Masal sıkıştığı tarafından sedasyon seviyesini kontrol edin, sonra karın saç klibi. Steril Oftalmik merhem ile gözleri yağlayın ve bir yastık üzerinde bir dorsal recumbence pozisyonda fare yerleştirin. Betadine ve alkol pedleri ile karın dezenfekte edin. Costeril bir örtü ile fareyi ver ve sadece kesi alanı açığa.
4. Suprapubik bölgeye xiphoid aşağıdan bir orta hat laparotomi kesi yapmak ve bir öz-istinat ekartörünü yerleştirin. Tuzlu çözelti ile nemlendirilmiş gazlı bez bağırsakları sarın. Açık açık infrarenal aorta ve vena kava tanımlar.
5. Proksimal ve aort ve vena kava distal taraflarında iki mikro vasküler kelepçeler yerleştirin sonra açık açık vena kava transekt vena kava gelen aort ayrı. Gerekirse, konik iğne üzerinde 10-0 monofilament sütür ile abdominal aort dalları Arter.
6. Steril 10-0 sütür kullanılarak anastomoz sonuna yakın ve uzak ucu ile alt vena kava interpozisyonundan greft dikiniz. Fare anatomisine bağlı greft, genellikle 1-2 mm, Trim. Proksimal ve distal uçlarında hem bir tane dikiş greft elde edin ve greft diğer taraftan 4-5 stiches sürekli dikiş başlar. Ön tarafı bitirdikten sonra, kelepçeler ve greftler çevirmekdiğer tarafa ve greft arka tarafını dikin. Implantasyon sırasında, akut trombozu önlemek için sık sık heparin solüsyonu ile greft yıkayın.
7. Proksimal kelepçesini çıkarın ve bir topikal emilebilir steril hemostat ajanı uygulayarak kanamayı kontrol. Kanama tamamen durduğunda, distal kelepçesini çıkarın ve kanama aynı şekilde kontrol. Greft içinden emin kan akışları olun.
8. Dahil dişli bir iğne ile 6-0 siyah bir poliamid monofilament dikiş ile iki kat olarak abdominal kas ve deri kapatın.
9. 0.5 ml serum fizyolojik subkutan enjekte edilir ve fare tamamen mobil kadar bir ısınma pad üzerinde bir kurtarma kafes fare yerleştirin. Kurtarma üzerine, kağıt yatak ile yeni kafesine fareyi dönmek. 48 saat boyunca ağrı ilaç (ibuprofen, 30 mg / kg, içme suyu) ver.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

TEVG implantasyonu şematik, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kemik iliği, verici bir fare hasat edilmiştir ve mono nükleer hücreler yoğunluk santrifüj ile izole edildi ve daha sonra biyolojik olarak parçalanabilir bir yapı iskeleti üzerine ekildi. Numaralı seribaşı iskeleleri O / N bekletilir ve bir alt vena kava greft interpozisyonu gibi bir alıcı fareye implante edildi.

Şekil 2, PGA-P (CL / LA) iskele taramalı elektron mikroskobu göster...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

TEVG fare modeli neotissue stenoz oluşumu ve geliştirilmesi hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir araçtır. Tohumlanmış BM-MNC greft ¹¹ tohumlanmış hücreleri hem histolojik ve SEM görüntüleri gösterilmiştir. Hücre Ekme etkinliği, bir DNA deneyi ⁷ ile gösterilmiştir. Bu model sistemi kullanarak biz cep tohumlama insan klinik deneme ³ başarısızlık birincil modu oldu TEVG stenoz, gelişiminin insidansını azalttığını göstermiştir. To...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500