Имплантация нижней полой вены вмешательство трансплантат в мышиной модели

Резюме

Для улучшения наших знаний о клеточной и молекулярной neotissue образования, мышиным модель TEVG Недавно был разработан. В трансплантаты были имплантированы как инфраренальной полой вены вмешательство трансплантатов в C57BL / 6 мышей. Эта модель достигает подобных результатов тем, которые достигаются в нашем клиническом исследовании, но за гораздо меньшее время цикла.

Аннотация

Биологически леса, посеянные с одноядерных клеток костного мозга (контроллеров BMC) часто используются для реконструктивной хирургии для лечения врожденных сердечных аномалий. Долгосрочные клинические результаты показали отличные цены проходимости, однако, со значительным заболеваемости стеноза. Для исследования клеточных и молекулярных механизмов neotissue формирования сосудистой и предотвратить развитие стеноза в тканевых инженерии сосудистых трансплантатов (TEVGs), мы разработали модель мыши трансплантата с примерно 1 мм с внутренним диаметром. Во-первых, TEVGs были собраны из биоразлагаемых трубчатых лесов, изготовленных из нетканого материала полигликолевая кислоты чувствовал сетка с покрытием с ε-капролактона и L-лактида сополимера. Каркасах помещали в лиофилизатор, пылесосом в течение 24 ч и хранили в эксикаторе до посева клеток. Во-вторых, костный мозг брали из мышей-доноров и мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности. В-третьих, приблизительно один миллион клеткивысевают на эшафоте и инкубировали O / N. И, наконец, отобранные леса были затем имплантируют в качестве инфраренального полой вены трансплантатов вмешательство в C57BL / 6 мышей. Имплантированные трансплантаты продемонстрировал отличную проходимость (> 90%) без признаков тромбоэмболических осложнений или образование аневризмы. Это мышиной модели поможет нам в понимании и количественной клеточные и молекулярные механизмы neotissue образования в TEVG.

Введение

Врожденные пороки сердца серьезные условия, которые влияют почти 8% живорожденных в США. Примерно 25% из тех детей с врожденными пороками сердца или 2,4 на 1000 живорожденных, требуют инвазивных методов лечения в первый год их жизни ^1. Наиболее эффективным средством для лечения врожденных пороков сердца является реконструктивная хирургия. К сожалению, осложнения, связанные с использованием имеющихся в настоящее время сосудистых трубопроводов являются наиболее существенной причиной послеоперационной заболеваемости и смертности.

Для решения этой проблемы мы разработали первые ткани инженерии сосудистых трансплантатов (TEVGs) для клинического применения ^2. TEVGs были построены из биоразлагаемых полиэфирных труб посеянных с аутологичных костного мозга производного мононуклеаров (BM-МНК) и имплантированных как венозных каналов для врожденной сердечной хирургии. Результаты показали отличные показатели проходимости на 1-3 лет последующей деятельности, но со значительным заболеваемости стеноза 3,4. Было ясно, что лучшее понимание формирования сосудистого neotissue и механизма, лежащего в основе развития TEVG стеноза было необходимо. Для того, чтобы лучше понять развитие TEVGs и механизм развития стеноза, модель овец была создана ^5,6. В этой модели, TEVGs успешно преобразован в живых судов и были подобны в обеих морфологии и функции родных вен. Это использование большого животной модели было хорошим первым шагом в предоставлении важную доклинических информацию, которые помогли клиническую использование TEVGs. Тем не менее, полное понимание клеточных и молекулярных механизмов сосудистой neotissue образования в TEVGs, использующих большие животные модели ограничен из-за ограничений в области молекулярной характеристики клеточных фенотипов сосудистых из-за отсутствия видов конкретных молекулярных инструментов. Чтобы преодолеть эти недостатки, на мышиной модели TEVGs была разработана по причине быстрого развития в области генетики мыши и их обширной молекулег характеристика с дополнительным преимуществом укороченной масштабе времени.

Мышиный IVC вмешательство модель добросовестно перечислил процесс neovessel образования, что происходит в больших животных и человека, но за гораздо более короткое время, конечно ^6-9. Здесь подробный протокол для малого трансплантата производства с использованием биологически леса, сбор урожая БМ-MNC и изоляция, БМ-MNC посев на эшафот, и трансплантат имплантации в мышиной модели были описаны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные процедуры были одобрены комитетом больницы Уходу за животными и использовать Национальная детская мимо.

1. Прививка Производство

1. Сделать ε-капролактон и L-лактид сополимер P (LA / CL) решение, добавив 100 мг P (LA / CL) в 2 мл диоксана под вытяжкой. Поместите решение на вихрь и смешать непрерывно в течение 1-1,5 ч до полного растворения.
2. В то же время, удалить лист полигликолевой кислоты (PGA) чувствовал из морозильника и вырезать несколько 5 х 8 мм разделов. Также отрезать кончик 0,1-10 мкл пипетки чуть выше фильтра.
3. Вставка 19 G иглу (1,5 длина) в дистальный конец наконечника пипетки и обернуть PGA чувствовал вокруг иглы с помощью микро щипцы.
4. Осторожно вставить войлок к дистальному концу наконечника пипетки, где просвет ровнее, чем проксимальной части, с помощью тупой иглы 18 G, в то время как 19 G игла вставлена ​​в него.
5. Пипетка40 мкл P (CL / LA) раствор в наконечник пипетки сверху. Насытить PGA чувствовал с решением. Затем нажмите пузырьки воздуха с помощью пипетки дозатор. Повторите этот процесс, если это необходимо.
6. Место прививки в 50 мл трубки и поместить его в -80 ° C морозильник на 20 мин. Убедитесь, что глава игл лицом вниз.
7. Передача трубку в лиофилизатор и вакууме в течение 24 часов. Убедитесь в том, чтобы открыть крышку трубки иметь воздушный поток.
8. Выньте трансплантатов и удалить их из хвои. Отрежьте оба конца трансплантата, оставляя мм раздел ~ 5 и положил их обратно на иглы, чтобы сохранить свою форму. Держите трансплантатов в эксикаторе.
9. Поместите на эшафот под УФ-светом в области биобезопасности капот O / N до посева клеток.

2. Костного мозга мононуклеарных клеток Заготовка и Изоляция

1. Усыпить мышей с кетамин / ксилазина передозировки (кетамин, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг).
2. Удалить кости (бедраг Большеберцовые кости) от 3 мышей в течение 10 привитых имплантаций и поместить в чашку Петри с 10 см RPMI. Отрежьте оба конца костей и флеш костного мозга с помощью шприца с 25 G иглой в новую чашку Петри с 3 см RPMI. Сбор костный мозг и решение RPMI в 15 см трубки и мыть чашку Петри с дополнительным 2 см RPMI собрать оставшуюся часть BM.
3. Возьмите образец (5-10 мкл) и количество клеток с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Запись результат.
4. Положите 5 см Ficoll в 15 см трубки центрифуги и добавить костный мозг и решение RPMI. Добавить решение очень осторожно, чтобы не допустить его смешения с фиколла.
5. Центрифуга в 528 мкг в течение 30 мин с "НИ Тормоз" при 24 ° С
6. Снимите верхнюю розовый слой. Сбор средний прозрачный слой рисунок 1, который является слой MNC, и разбавить его с PBS 1:1.
7. Центрифуга разбавленный MNC решение на 528 мкг в течение 10 мин при 24 ° С
8. Удалить супернатант и дилютневая осадок с 5 мл PBS.
9. Центрифуга гранул решение на 528 мкг в течение 10 мин при 24 ° С
10. Удалить супернатант. Развести гранул с соответствующим объемом RPMI (~ 200 мкл).
11. Возьмите 5-10 мкл пробы и подсчета клеток с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Запись результат. Повторите ячейку считая еще раз и рассчитать среднее количество клеток.
12. Развести концентрации клеток до 1000000 cells/10 мкл с использованием RPMI.

3. Сотовый Посев

1. Предварительно смочите эшафот добавлением 5 мкл RPMI люминально в течение 5 мин, затем снимите RPMI.
2. Добавить 10 мкл костного мозга, полученных моно ядерных клеток в RPMI с шага 2.12 до лесов просвета и ждать 10 минут, чтобы позволить клеткам прикрепляться на эшафот.
3. Вырежьте иглу 19 G 1 см длиной и положил иглу в просвет эшафот, чтобы держать форму на эшафот. Поместите образец в 24-луночный планшет.
4. Добавить 1000 мкл RPMI в каждую лунку и инкубировать O / N в инкубаторе.

4. Прививка Имплантация

1. Автоклав все хирургические инструменты перед операцией: 1x тонких ножниц, 3x микро щипцы, 2x микро сосудистые зажимы, 1x зажим, применяющие щипцы, 1x микро держатель иглы, 1x весенние ножницы, 1x втягивающим.
2. 6-8 недель женский C57BL / 6 используются в качестве ткани инженерии сосудистых получателей привитых. Удалить мыши из клетки и взвешивают его, а затем анестезию путем внутрибрюшинной инъекции в правом нижнем квадранте живота с кетамин / ксилазина коктейль (кетамин, 100 мг / кг и ксилазина, 10 мг / кг). Кетопрофен (5 мг / кг, внутрибрюшинно) используется в качестве предварительной анестезии анальгетик.
3. Проверьте уровень седации по сказке щипать, то клип брюшной волосы. Смажьте глаза стерильной глазной мази, и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Лечить живот бетадином и алкогольной колодки. КолорадоVer мышь с стерильной драпировки и разоблачить область разреза только.
4. Сделайте срединный лапаротомии разрез от ниже xyphoid к надлобковой области, и вставить самоудерживающиеся втягивающим. Оберните кишечник в солевом смоченной марлей. Грубо определить инфраренальной аорту и полую вену.
5. Поместите два микро сосудистые зажимы на обоих проксимальных и дистальных сторон аорты и полой вены, то тупо отделить аорты от полой вены Разрез полой вены. При необходимости перевязывать брюшной аорты ветви с 10-0 мононити швов на конических игл.
6. Имплантировать нижней полой вены вмешательство трансплантата с проксимального и дистального конца до конца анастомозов с помощью стерильного 10-0 шов. Обрежьте трансплантата, как правило, 1-2 мм, в зависимости от анатомии мыши. Закрепите трансплантата с одной строчкой на обоих ближним и дальним концами и начать сшивать непрерывно с 4-5 Stiches с другой стороны трансплантата. После окончания переднюю сторону, перевернуть зажимы и трансплантатовна другую сторону и шов заднюю сторону трансплантата. Во время имплантации, промойте трансплантат раствором гепарина часто, чтобы предотвратить острый тромбоз.
7. Снимите ближний зажим и контролировать кровотечение, применяя актуальные рассасывающиеся стерильную кровоостанавливающего средства. Когда кровотечение останавливается полностью, удалить дистальный зажим и контролировать кровотечение так же. Убедитесь, что потоки крови через трансплантат.
8. Закройте брюшной мускулатуры и кожи в два слоя с использованием 6-0 черный полиамид мононити шов с включенным резьбовым иглы.
9. Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно и поместите курсор в восстановление клетке на потепление площадку, пока мышь не является полностью мобильным. После восстановления, возвращения мышь на новую клетку с бумажной постельные принадлежности. Дайте обезболивающее (ибупрофен, 30 мг / кг, питьевой воды) в течение 48 часов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Схема TEVG имплантации показано на рисунке 1. Костный мозг был собран из мыши-донора и моно ядерные клетки выделяли с помощью центрифугирования плотности, а затем высевали на биоразлагаемого строительных лесов. В очищенных от семян леса инкубировали O / N и имплантировали в мыши-р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модель мыши TEVG является ценным инструментом для изучения клеточных и молекулярных механизмов neotissue формирования и развития стеноза. Отобранный БМ-MNC было показано в обоих гистологических и SEM образов сеяных клеток на трансплантата ^11. Эффективность посева клеток было также показ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500