L'impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Riepilogo

Per migliorare la nostra conoscenza della formazione neotissue cellulare e molecolare, un modello murino della TEVG è stata sviluppata di recente. Gli innesti sono stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Questo modello raggiunge risultati simili a quelli ottenuti nella nostra ricerca clinica, ma nel corso di un time-course di gran lunga ridotto.

Abstract

Scaffold biodegradabili seminati con cellule mononucleari del midollo osseo (BMC) sono spesso utilizzati per la chirurgia ricostruttiva per il trattamento di anomalie cardiache congenite. I risultati clinici a lungo termine hanno mostrato ottimi tassi di pervietà, tuttavia, con una significativa incidenza di stenosi. Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue vascolare e prevenire lo sviluppo di stenosi in ingegneria tessutale innesti vascolari (TEVGs), abbiamo sviluppato un modello murino dell'innesto con circa 1 mm di diametro interno. In primo luogo, le TEVGs stati assemblati da impalcature tubolari biodegradabili fabbricate da un tessuto non tessuto di acido poliglicolico feltro maglia rivestito con ε-caprolattone e L-lattide copolimero. I ponteggi sono stati poi collocati in un liofilizzatore, aspirati per 24 ore, e conservati in un essiccatore fino semina delle cellule. In secondo luogo, midollo osseo è stato prelevato da topi donatori e cellule mononucleari sono stati isolati da centrifugazione in gradiente di densità. Terzo, circa un milione di cellule eranoseminate su un ponteggio e incubati O / N. Infine, i ponteggi seminati stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Gli innesti impiantati dimostrato eccellente pervietà (> 90%), senza evidenza di complicanze tromboemboliche o di formazione aneurismatica. Questo modello murino ci aiuterà a comprendere e quantificare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue nel TEVG.

Introduzione

Difetti cardiaci congeniti sono condizioni gravi che colpiscono circa l'8% dei nati vivi negli Stati Uniti. Circa il 25% di questi neonati con difetti cardiaci congeniti o 2,4 per 1.000 nati vivi, richiedono un trattamento invasivo nel primo anno della loro vita ^1. Il trattamento più efficace per la malattia cardiaca congenita è la chirurgia ricostruttiva. Purtroppo, complicazioni derivanti dall'uso di condotti vascolari attualmente disponibili sono la causa più importante di morbilità e mortalità postoperatoria.

Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato i primi di ingegneria tessutale innesti vascolari (TEVGs) per uso clinico ^2. TEVGs sono stati costruiti con tubi in poliestere biodegradabile seminati con autologo di midollo osseo cellule derivate-mononucleari (BM-MNC) e impiantati come condotti venosi per la chirurgia cardiaca congenita. I risultati hanno mostrato ottimi tassi di pervietà a 1-3 anni di follow-up, ma con una significativa incidenza di stenosi ^{3,4. Era chiaro che era necessaria una migliore comprensione della formazione neotissue vascolare e il meccanismo alla base dello sviluppo di TEVG stenosi. Per comprendere meglio lo sviluppo di TEVGs e il meccanismo di sviluppo stenosi, un modello ovino emo 5,6. In questo modello, i TEVGs trasformata con successo in navi viventi e erano simili in entrambi morfologia e la funzione delle vene native. Questo uso di un grande modello animale era un buon primo passo per fornire importanti informazioni pre-clinico che ha aiutato l'uso clinico di TEVGs. Tuttavia, la piena comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue vascolare in TEVGs utilizzando modelli animali di grandi dimensioni è limitata a causa di limitazioni nella caratterizzazione molecolare dei fenotipi di cellule vascolari a causa della mancanza di strumenti di specie molecolari specifici. Per superare queste carenze, un modello murino di TEVGs è stato sviluppato a causa del rapido progresso nel campo della genetica mouse e la loro vasta moleculaCaratterizzazione r con il vantaggio aggiunto di una scala temporale ridotta.}

Il murino IVC modello interposizione fedelmente ricapitolato il processo di neovessel di formazione che si verifica in grandi animali e nell'uomo, ma nel corso di un corso di tempo molto più breve ^6-9. Qui, un protocollo dettagliato per la produzione innesto su piccola scala utilizzando scaffold biodegradabili, BM-MNC raccolta e l'isolamento, BM-MNC semina sull'impalcatura, e l'impianto innesto in un modello murino sono stati descritti.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla Hospital Institutional Animal Care ed uso Comitato dei Bambini di Nationwide.

1. Graft Manufacturing

1. Rendere la soluzione ε-caprolattone e L-lattide copolimero P (LA / CL) aggiungendo 100mg P (LA / CL) in 2 ml di diossano sotto una cappa aspirante. Mettere la soluzione in un vortice e mescolare continuamente per 1-1,5 ore per sciogliere completamente.
2. Nel frattempo, rimuovere un foglio di acido poliglicolico (PGA) feltro dal congelatore e tagliare diverse sezioni 5 x 8 mm. Anche tagliare la punta di una pipetta microlitri 0,1-10 appena sopra il filtro.
3. Inserire un ago G 19 (1,5 di lunghezza) nella estremità distale di un puntale e avvolgere il PGA sentire in tutto il ago utilizzando micro pinze.
4. Attentamente spingere il feltro all'estremità distale della punta della pipetta, dove il lume è dritto di parte prossimale, utilizzando un ottuso ago 18 G, mentre il ago G 19 è inserito in esso.
5. PipettaSoluzione al 40 microlitri P (CL / LA) nella punta della pipetta dall'alto. Saturare il PGA feltro con la soluzione. Poi spingere le bolle d'aria utilizzando un dispenser pipetta. Ripetere questo processo, se necessario.
6. Luogo innesti in un tubo da 50 ml e collocarlo in una -80 ° C freezer per 20 minuti. Assicurarsi che la testa degli aghi faccia verso il basso.
7. Trasferire la provetta in un liofilizzatore e vuoto per 24 ore. Assicurarsi di aprire il coperchio del tubo di avere il flusso d'aria.
8. Estrarre gli innesti e rimuoverli dagli aghi. Tagliare entrambe le estremità dell'innesto lasciando una sezione ~ 5 mm e riporli sugli aghi per mantenere la loro forma. Mantenere gli innesti in un essiccatore.
9. Posizionare il patibolo sotto la luce UV in una cappa di biosicurezza O / N prima della semina delle cellule.

2. Midollo osseo Mononuclear raccolta di cellule e di isolamento

1. Euthanize i topi con overdose di ketamina / xylazina (ketamina, 200 mg / kg e xylazina, 20 mg / kg).
2. Rimuovere le ossa (femore di und tibie) da 3 topi per 10 impiantazioni innesto e posto in una capsula di Petri con 10 cc RPMI. Tagliare le due estremità delle ossa e filo midollo osseo utilizzando una siringa con un ago 25 G in una nuova piastra di Petri con 3 cc RPMI. Raccogliere midollo osseo e soluzione RPMI in una provetta da 15 cc e lavare la capsula di Petri con ulteriori RPMI 2 cc per raccogliere la restante BM.
3. Prendere campione (5-10 microlitri) e conta delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o emocitometro. Registrare il risultato.
4. Mettere 5 cc Ficoll in una provetta da 15 cc centrifuga e aggiungere midollo osseo e soluzione RPMI. Aggiungere la soluzione molto delicatamente per evitare che la miscelazione con Ficoll.
5. Centrifugare a 528 xg per 30 minuti con "NO FRENO" a 24 ° C.
6. Rimuovere lo strato superiore di colore rosa. Raccogliere lo strato centrale chiara Figura 1, che è lo strato MNC, e diluire con PBS 1:1.
7. Centrifugare la soluzione diluita MNC a 528 xg per 10 min a 24 ° C.
8. Rimuovere il surnatante e diliuto il pellet con 5 ml di PBS.
9. Centrifugare pellet a 528 xg per 10 min a 24 ° C.
10. Rimuovere il surnatante. Diluire il pellet con il volume appropriato di RPMI (~ 200 microlitri).
11. Prelevare un campione microlitri 5-10 e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o emocitometro. Registrare il risultato. Ripetere la cella contando ancora una volta e calcolare il numero medio di cellule.
12. Diluire la concentrazione cellulare a 1.000.000 cells/10 microlitri utilizzando RPMI.

3. Semina cellulare

1. Scaffold Prewet con l'aggiunta di 5 ml RPMI luminally per 5 minuti, quindi rimuovere RPMI.
2. Aggiungere 10 ml di midollo osseo derivate mono cellule nucleari in RPMI dal punto 2.12 al lume ponteggio e attendere 10 minuti per consentire alle cellule di attaccare sul patibolo.
3. Tagliare un ago 19 G per 1 cm di lunghezza e mettere l'ago nel lume del ponteggio per mantenere la forma del ponteggio. Trasferire il campione in una piastra da 24 pozzetti.
4. Aggiungere 1,000 ml RPMI a ciascun pozzetto e incubare O / N in un incubatore.

4. Graft impianto

1. Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima della chirurgia: 1x forbici sottili, 3x micro pinze, pinze vascolari micro 2x, 1x morsetto pinze applicano, porta-aghi micro 1x, forbici primavera 1x, 1x divaricatore.
2. 6-8 settimane vecchia femmina C57BL / 6 sono usati come ingegneria tessutale destinatari innesto vascolare. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi anestetizzare attraverso un'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore destro dell'addome con un cocktail di ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg e xilazina, 10 mg / kg). Ketoprofene (5 mg / kg, IP) è usato come un analgesico pre-anestesia.
3. Controllare il livello di sedazione da pizzicare racconto, poi ritagliare i capelli addominale. Lubrificare gli occhi con pomata oftalmica sterile, e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Disinfettare l'addome con Betadine e alcool pastiglie. Cover il mouse con un telino sterile ed esporre solo la zona di incisione.
4. Effettuare una laparotomia mediana incisione da sotto la xifoidea alla regione sovrapubica, e inserire un divaricatore di auto-conservazione. Avvolgere l'intestino in soluzione salina inumidito garza. Senza mezzi termini definire l'aorta sottorenale e la vena cava.
5. Inserire due micro pinze vascolari su entrambi i lati prossimale e distale della aorta e vena cava poi senza mezzi termini separare l'aorta dalla vena cava Transect la vena cava. Se necessario, legare i rami dell'aorta addominale con un 10-0 monofilamento sugli aghi conici.
6. Impiantare una vena cava inferiore interposizione di innesto con l'estremità prossimale e distale di anastomosi terminare con una sterile 10-0 sutura. Tagliare il trapianto, di solito 1-2 mm, a seconda dell'anatomia del mouse. Fissare l'innesto con un punto su entrambi estremità prossimale e distale e inizia a suturare continuamente con 4-5 stiches dall'altro lato dell'innesto. Dopo aver terminato la parte anteriore, capovolgere i morsetti e innestiverso l'altro lato e suturare il lato posteriore dell'innesto. Durante l'impianto, lavare l'innesto con la soluzione di eparina frequentemente per evitare la trombosi acuta.
7. Rimuovere il morsetto prossimale e controllare l'emorragia applicando una topica agente emostatico sterile riassorbibile. Quando l'emorragia si arresta completamente, rimuovere il morsetto distale e controllare l'emorragia allo stesso modo. Assicurarsi che il sangue scorre attraverso l'innesto.
8. Chiudere la muscolatura addominale e la pelle in due strati con un 6-0 nera in poliammide monofilamento di sutura con ago filettato incluso.
9. Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare il mouse in una gabbia di recupero su un rilievo di riscaldamento fino a quando il mouse è completamente mobile. Al momento del recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia con biancheria da letto di carta. Dare farmaci antidolorifici (ibuprofene, 30 mg / kg, acqua potabile) per 48 ore.

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Risultati

Uno schema di TEVG impianto è mostrato in Figura 1. Midollo osseo è stato raccolto da un topo donatore e mono cellule nucleari sono stati isolati mediante centrifugazione densità e quindi seminate su uno scaffold biodegradabile. Gli scaffold seminati sono stati incubati O / N e impiantati a un mouse destinatario come la vena cava inferiore interposizione innesto.

La Figura 2 illustra la microscopia elettronica a scansione del ponteggio PGA-P (CL / LA). Il...

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Discussione

Il modello murino di TEVG è uno strumento prezioso per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione neotissue e lo sviluppo di stenosi. La testa di serie BM-MNC stato mostrato in entrambe le immagini istologiche e SEM delle cellule inseminate sulla marza ^11. Efficienza semina delle cellule è stata anche dimostrata utilizzando un test DNA ^7. Usando questo sistema modello abbiamo dimostrato che semina delle cellule riduce l'incidenza dello sviluppo di TEVG stenosi, che era la p...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500