マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

要約

細胞および分子新組織形成の我々の知識を向上させるために、TEVGのマウスモデルは、最近開発されました。グラフトは、C57BL / 6マウスにおける大動脈大静脈介在移植片として移植した。このモデルは、私たちの臨床研究で達成されるものと同様の結果を達成するが、はるかに短縮され、時間経過とともに。

要約

骨髄単核細胞（のBMC）を播種した生分解性の足場は、しばしば、先天性心臓異常を治療するための再建手術のために使用される。長期臨床結果は、狭窄の有意な発生率が、優れた開存率を示した。血管新組織形成の細胞および分子機構を調査し、組織工学血管移植片（TEVGs）に狭窄発症を予防するために、我々は、約1mmの内径を有する移植片のマウスモデルを開発した。まず、ポリグリコール酸不織布から製造生分解性の管状の足場から組み立てたTEVGs、ε-カプロラクトンとL-ラクチド共重合体でコーティングされたメッシュと感じました。足場は、次いで、凍結乾燥機に入れ、24時間真空にし、細胞播種するまでデシケーター中に保存した。次に、骨髄を、ドナーマウスから採取し、単核細胞を、密度勾配遠心分離によって単離した。第三に、約100万個の細胞であった足場に播種し、O / Nインキュベート最後に、播種された足場は、その後、C57BL / 6マウスにおける大動脈大静脈介在移植片として移植した。注入された移植片は、血栓塞栓合併症や動脈瘤の形成の証拠がなく、優れた開存性（> 90％）を示した。このマウスモデルは、理解で私たちを助け、TEVGに新組織形成の細胞および分子メカニズムを定量化します。

概要

先天性心疾患は、米国の出生の約8％に影響を与える深刻な状況である。先天性心疾患または2.4千あたりの出生とのそれらの乳児の約25％が、自分の人生¹の最初の年に侵襲的な治療を必要とする。先天性心疾患のための最も有効な治療は、再建手術である。残念ながら、現在利用可能な血管導管の使用に起因する合併症は術後の罹患率と死亡率の最も重要な原因である。

この問題に対処するために、我々は、臨床使用のために第²組織工学血管移植片（TEVGs）を開発した。 TEVGsは、自家骨髄由来の、単核細胞（BM-MNCを）を播種し、先天性心臓手術のための静脈の導管として移植生分解性ポリエステルチューブから構築した。結果は、フォローアップの1〜3年で優れた開存率を示したが、狭窄の重要な発生率まで。これは、血管新組織形成とTEVG狭窄の開発の基礎となるメカニズムのよりよい理解が必要であることは明らかであった。より良いTEVGsの開発や狭窄開発のメカニズムを理解するためには、ヒツジモデルは^5,6を作成しました。このモデルでは、TEVGs正常生体血管に変換され、天然の静脈の形態と機能の両方において同様であった。大型動物モデルの使用はTEVGsの臨床使用量を助け、重要な前臨床情報を提供する上で良い最初のステップでした。しかし、大規模な動物モデルを用いTEVGsの血管新組織形成の細胞および分子メカニズムの完全な理解は原因種特異的分子ツールが....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

注：すべての動物の手続きは、全国の小児病院施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1。グラフトづくり

1. ヒュームフードの下に2ミリリットルのジオキサンに100mgのPは（LA / CL）を追加することにより、ε-カプロラクトンとL-ラクチド共重合体P（LA / CL）の溶液を作製。渦上に溶液を置き、完全に溶解する1〜1.5時間、連続して混ぜる。
2. 一方、ポリグリコール酸（PGA）のシートを削除冷凍庫から感じた、いくつかの5×8ミリメートルの部分を切り取る。また、単にフィルター上0.1〜10μlのピペットの先端を切り落とした。
3. ピペットチップの先端部に19gの針（1.5長さ）を挿入し、PGAはマイクロピンセットを用いて、針の周りに感じ包む。
4. 19 Gの針をその中に挿入されている間、慎重に、内腔が鈍い18 Gの針を使用して、近位部よりも直線的であるピペットチップの先端にフェルトを押してください。
5. ピペット上からピペットチップに40μlのP（CL / LA）ソリューションを提供します。 PGAは、溶液と感じ飽和する。次いで、ピペットディスペンサーを用いて気泡を押し出す。 必要な場合には、このプロセスを繰り返す。
6. 場所の50ミリリットルチューブ内移植片および20分間-80℃の冷凍庫に入れてください。針の頭は下向きにしてください。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

TEVG注入の概略図を図1に示されている。骨髄は、ドナーマウスから採取し、単核細胞を密度遠心分離を用いて単離し、その後、生分解性足場上に播種する。シードされた足場は、O / Nインキュベートし、下大静脈の介在移植片としてレシピエントマウスに移植した。

図2は、PGA-P（CL / LA）骨格の走査型電子顕微鏡を示す。内径は約1mmであり、壁の.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

TEVGのマウスモデルは、新組織形成と狭窄の開発の細胞および分子メカニズムを研究するための貴重なツールです。シードされたBM-MNCが移植¹¹に播種した細胞の組織学的およびSEM画像の両方で示された。細胞播種の効率はまた、DNAアッセイ^7を用いて示された。このモデル系を用いて、我々は、細胞播種が私たち人間の臨床試験³の故障の主なモードだっTEVG狭窄の開発の.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500