Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Resumen

Para mejorar nuestro conocimiento de la formación de neotejido celular y molecular, un modelo murino de la TEVG fue desarrollado recientemente. Los injertos fueron implantados como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Este modelo logra resultados similares a los obtenidos en nuestra investigación clínica, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto.

Resumen

Andamios biodegradables sembrados con células mononucleares de médula ósea (BMC) se utilizan a menudo para la cirugía reconstructiva para tratar las anomalías cardíacas congénitas. Los resultados clínicos a largo plazo mostraron excelentes tasas de permeabilidad, sin embargo, con una incidencia significativa de la estenosis. Para investigar los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido vascular y prevenir el desarrollo de estenosis en la ingeniería tisular injertos vasculares (TEVGs), hemos desarrollado un modelo de ratón del injerto con aproximadamente 1 mm de diámetro interno. En primer lugar, los TEVGs fueron ensambladas a partir de los andamios tubulares biodegradables fabricadas a partir de un material no tejido de ácido poliglicólico sintieron malla recubierta con copolímero de ε-caprolactona y L-lactida. Los andamios se colocaron entonces en un liofilizador, la aspiradora durante 24 horas, y se almacenaron en un desecador hasta la siembra de células. En segundo lugar, la médula ósea se obtuvieron de ratones donantes y las células mononucleares se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad. En tercer lugar, aproximadamente un millón de células fueronsembradas en un andamio y se incubaron O / N. Por último, las células sembradas se implantan a continuación como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Los injertos implantados demostraron excelente permeabilidad (> 90%) sin evidencia de complicaciones tromboembólicas o formación de aneurisma. Este modelo murino nos ayudará en la comprensión y la cuantificación de los mecanismos celulares y moleculares de la formación de neotejido en el TEVG.

Introducción

Las cardiopatías congénitas son enfermedades graves que afectan a casi el 8% de los nacimientos vivos en los Estados Unidos. Aproximadamente el 25% de los recién nacidos con defectos congénitos del corazón o de 2,4 por 1.000 nacidos vivos, requieren tratamiento invasivo en el primer año de su vida ^1. El tratamiento más efectivo para la enfermedad cardiaca congénita es la cirugía reconstructiva. Por desgracia, las complicaciones derivadas de la utilización de conductos vasculares actualmente disponibles son la causa más importante de morbilidad y mortalidad postoperatorias.

Para solucionar este problema, hemos desarrollado los primeros ingeniería tisular injertos vasculares (TEVGs) para uso clínico ^2. TEVGs se construyeron a partir de tubos de poliéster biodegradables sembradas con médula ósea autóloga células mononucleares derivadas (CMN-MO) y implantados como conductos venosos para la cirugía cardíaca congénita. Los resultados mostraron excelentes tasas de permeabilidad a 1-3 años de seguimiento, pero con incidencia significativa de la estenosis 3,4. Estaba claro que era necesaria una mejor comprensión de la formación neotejido vascular y el mecanismo subyacente a la aparición de estenosis TEVG. Con el fin de comprender mejor el desarrollo de TEVGs y el mecanismo de desarrollo de la estenosis, un modelo ovino se ha creado ^5,6. En este modelo, los TEVGs transformaron con éxito en los vasos que viven y fueron similares tanto en la morfología y la función de las venas nativas. Este uso de un modelo animal de gran tamaño era un buen primer paso para proporcionar información importante sobre la pre-clínico que ayudó el uso clínico de TEVGs. Sin embargo, la plena comprensión de los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido vascular en TEVGs utilizando modelos animales grandes es limitada, debido a las limitaciones en la caracterización molecular de fenotipos de células vasculares debido a la falta de especies de herramientas moleculares específicas. Para superar estas deficiencias, un modelo murino de TEVGs fue desarrollado por razón del rápido avance de la genética del ratón y su extensa moleculacaracterización r con la ventaja añadida de una escala de tiempo más corta.

El modelo murino interposición IVC recapitula fielmente el proceso de formación de neovasos que se produce en grandes animales y los seres humanos, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto ^6-9. Aquí, un protocolo detallado para la fabricación del injerto a pequeña escala usando andamios biodegradables, se describe BM MNC-recolección y el aislamiento, la BM MNC-siembra en andamio, y la implantación del injerto en un modelo murino.

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Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité del Hospital Institucional Cuidado de Animales y Uso de los Niños de Nationwide.

1. Injerto de fabricación

1. Hacer la solución ε-caprolactona y L-lactida copolímero P (LA / CL) mediante la adición de 100 mg de P (LA / CL) en 2 ml de dioxano bajo una campana de humos. Coloque la solución en un vórtice y se mezcla continuamente durante 1 a 1,5 horas para disolver completamente.
2. Mientras tanto, quitar una hoja de ácido poliglicólico (PGA) se sintió desde el congelador y cortar varias secciones 5 x 8 mm. También cortar la punta de un 0,1-10 l pipeta justo por encima del filtro.
3. Inserte una aguja de 19 (1,5 longitud) en el extremo distal de una punta de pipeta y envolver la PGA se sintió alrededor de la aguja utilizando micro forceps.
4. Empuje con cuidado el fieltro en el extremo distal de la punta de la pipeta, donde el lumen es más recto que la parte proximal, utilizando una aguja roma 18 g, mientras que el G aguja 19 se inserta en él.
5. Pipeta40 l P (CL / LA) solución en la punta de la pipeta de la parte superior. Saturar el PGA sentía con la solución. Luego empuje las burbujas de aire utilizando un dispensador de la pipeta. Repita este proceso si es necesario.
6. Coloque los injertos en un tubo de 50 ml y la colocan en un congelador de -80 ° C durante 20 min. Asegúrese de que el jefe de las agujas de bruces.
7. Transferir el tubo en un liofilizador y aspirar durante 24 horas. Asegúrese de abrir la tapa del tubo para que el flujo de aire.
8. Saque los injertos y sacarlos de las agujas. Corte ambos extremos del injerto dejando una sección de ~ 5 mm y volver a ponerlos sobre las agujas para mantener su forma. Mantener los injertos en un desecador.
9. Coloque el andamio a la luz ultravioleta en una siembra de células bioseguridad capó O / N antes.

2. Mononucleares de médula ósea La recolección de la célula y aislamiento

1. La eutanasia a los ratones con sobredosis de ketamina / xilazina (ketamina, 200 mg / kg y xilazina, 20 mg / kg).
2. Quite los huesos (fémur und tibias) de 3 ratones durante 10 implantaciones de injerto y colocar en una placa de Petri con 10 cc RPMI. Corte ambos extremos de los huesos y médula ósea ras utilizando una jeringa con una aguja de calibre 25 en una nueva placa de Petri con medio RPMI 3 cc. Recoger la médula ósea y la solución de RPMI en un tubo de 15 cc y se lava la placa de Petri con medio RPMI adicional 2 cc para recoger el resto de BM.
3. Toma de muestras (5-10 l) y el recuento de células utilizando un contador de células automatizado o hemocitómetro. Registre el resultado.
4. Ponga 5 cc de Ficoll en un tubo de centrífuga de 15 cc y añadir la médula ósea y la solución de RPMI. Añadir la solución muy suavemente para evitar que se mezcla con Ficoll.
5. Centrifugar a 528 xg durante 30 minutos con "NO FRENO" a 24 ° C.
6. Retire la capa rosada superior. Recoger la capa intermedia clara la Figura 1, que es la capa de MNC, y diluirla con PBS 1:01.
7. Centrifugar la solución MNC diluido a 528 xg durante 10 min a 24 ° C.
8. Eliminar el sobrenadante y dilaúd el sedimento con 5 ml de PBS.
9. Centrifugar la solución de pellets a 528 xg durante 10 min a 24 ° C.
10. Eliminar el sobrenadante. Diluir el sedimento con el volumen apropiado de medio RPMI (~ 200 l).
11. Tomar una muestra de l 5-10 y contar las células utilizando un contador de células automatizado o hemocitómetro. Registre el resultado. Repita la célula contando una vez más y calcular el número medio de celda.
12. Diluir concentración de células a 1.000.000 células/10 l usando medio RPMI.

3. Siembra de células

1. Andamio prehumedecido añadiendo 5 l RPMI luminally durante 5 minutos, luego retire RPMI.
2. Añadir 10 l de médula ósea procedentes de células mononucleares en RPMI del Paso 2,12 a luz andamios y esperar 10 minutos para permitir que las células se unan al andamio.
3. Cortar una aguja de 19 G hasta 1 cm de longitud y poner la aguja en el lumen del andamio para mantener la forma del andamio. Colocar la muestra en una placa de 24 pocillos.
4. Añadir 1000 l de RPMI a cada pocillo e incubar O / N en una incubadora.

4. Injerto de implantación

1. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía: 1x tijeras finas, 3x fórceps micro, pinzas vasculares micro de 2x, abrazadera 1x fórceps soliciten, sostenedor 1x micro aguja, tijeras de primavera 1x, 1x retractor.
2. 6-8 semanas de edad hembra C57BL / 6 se utilizan como ingeniería tisular receptores de injertos vasculares. Eliminar el ratón de su jaula y se pesa, entonces anestesiar a través de una inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen con un cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg y xilazina, 10 mg / kg). Ketoprofeno (5 mg / kg, ip) se usa como un analgésico de pre-anestesia.
3. Compruebe el nivel de sedación por pellizcos cuento, a continuación, cortar el pelo abdominal. Lubricar los ojos con un ungüento oftálmico estéril y colocar el ratón en una posición de decúbito dorsal sobre una almohadilla. Desinfectar el abdomen con almohadillas de betadine y alcohol. CoVer el ratón con un paño estéril y exponer sólo el área de la incisión.
4. Hacer una laparotomía de la línea media de la incisión por debajo de la xifoides a la región suprapúbica, e insertar un retractor de auto-retención. Envuelva los intestinos en solución salina gasa humedecida. Francamente definir la aorta infrarrenal y la vena cava.
5. Coloque dos pinzas vasculares micro tanto en lados proximal y distal de la aorta y la vena cava a continuación, separar sin rodeos la aorta desde la vena cava Transecta la vena cava. Si es necesario, ligar las ramas de la aorta abdominal con suturas monofilamento 10-0 sobre agujas afiladas.
6. Implantar una vena cava inferior con injerto de interposición extremo proximal y distal para terminar con anastomosis utilizando un 10-0 sutura estéril. Recorte el injerto, generalmente de 1-2 mm, dependiendo de la anatomía del ratón. Asegurar el injerto con una puntada en ambos extremos proximal y distal y empezar a suturar continuamente con 4-5 puntos de sutura desde el otro lado del injerto. Después de terminar la parte frontal, voltear las abrazaderas y los injertoshasta el otro lado y suturar la parte de atrás del injerto. Durante la implantación, lave el injerto con solución de heparina con frecuencia para prevenir la trombosis aguda.
7. Retire la abrazadera proximal y controlar la hemorragia mediante la aplicación de un agente de hemostato absorbible estéril tópica. Cuando la hemorragia se detiene por completo, retire la pinza distal y controlar la hemorragia de la misma manera. Hacer flujos sanguíneos seguros a través del injerto.
8. Cierre la musculatura abdominal y la piel de dos capas usando una sutura monofilamento 6-0 poliamida negro con aguja enhebrada incluido.
9. Inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea y colocar el ratón en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica hasta que el ratón es completamente móvil. Después de la recuperación, devuelva el ratón a una nueva jaula con ropa de cama de papel. Déle medicina para el dolor (ibuprofeno, 30 mg / kg, el agua potable) durante 48 horas.

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Resultados

Un diagrama esquemático de la implantación TEVG se muestra en la Figura 1. La médula ósea fue cosechada de un ratón donante y mono células nucleares se aislaron mediante centrifugación de densidad y luego sembró en un andamio biodegradable. Las células sembradas se incubaron O / N y se implantaron a un ratón receptor como una vena cava interposición de injerto inferior.

La Figura 2 ilustra la microscopía electrónica de barrido del andamio PGA-P ...

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Discusión

El modelo de ratón de TEVG es una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido y el desarrollo de la estenosis. La cabeza de serie BM-MNC se muestra en ambas imágenes histológicas y de SEM de las células sembradas sobre el injerto ^11. La eficiencia de la siembra de células también se demostró usando un ensayo de ADN ^7. El uso de este sistema modelo se demostró que la siembra de células reduce la incidencia del desarrollo de la estenosi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24-well plate	Corning	3526
15 cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	Gibco	14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118
Fine scissor	FST	14028-10
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Clamp applying forcep	FST	00072-14
S&T Vascular clamp	FST	00396-01
Spring scissors	FST	15008-08
Colibri retractors	FST	17000-04
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - fine forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Tish needle holder/forceps	Micrins	MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-woven sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1.5 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in, Needle	BD	305125
30 G 1 in, Needle	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Warming pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500