JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الجلكى البحر تفقد المرارة والقنوات الصفراوية خلال التحول، وهي عملية مشابهة لرتق القناة الصفراوية الإنسان. تم تعديل طريقة التثبيت الجديدة والتوضيح (وضوح) لتصور الشجرة الصفراوية بأكملها باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة الضمور الصفراوية.

Abstract

رتق القناة الصفراوية هو مرض نادر من مرحلة الطفولة، مع ما يقدر بنحو 1 في 15،000 تردد في جنوب شرق الولايات المتحدة، ولكن أكثر شيوعا في بلدان شرق آسيا، مع تردد تقارير عن 1 في 5،000 في تايوان. على الرغم من أن يعرف الكثير عن إدارة رتق القناة الصفراوية، المرضية له لا يزال بعيد المنال. الجلكى البحر (Petromyzon مارينوس) يوفر فرصة فريدة لدراسة آلية وتطور الضمور الصفراوية. الجلكى البحر تتطور من خلال ثلاث مراحل حياة متميزة: اليرقات والطفيلية، والكبار. خلال الانتقال من اليرقات الطفيلية إلى الأحداث، الجلكى البحر الخضوع التحول مع إعادة تنظيم وإعادة دراماتيكية في التشكل الخارجي، والأعضاء الداخلية. في الكبد، يتم فقدان نظام الصفراوي بأكمله، بما في ذلك المرارة والشجرة الصفراوية. تم تعديل طريقة تم تطويرها حديثا يسمى "وضوح" لتوضيح الكبد كامل وتقاطع مع الأمعاء المتحولة في الجلكى البحر. الوتصور عملية انحطاط الصفراوي وتمييزها خلال البحر الجلكى التحول باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة رتق القناة الصفراوية في نموذج حيواني فريدة من نوعها.

Introduction

الجلكى البحر تتطور من خلال ثلاث مراحل متميزة حياة 1،2. الجلكى البحر اليرقات (L) يقضون معظم الوقت في الجحور كما مغذيات الترشيح القاعية. بعد أن يمر سبع مراحل المتحولة من تغييرات جذرية في التشكل الخارجي، وإعادة التنظيم في الأعضاء الداخلية 3، والأحداث الناتجة (JV) تدخل مرحلة الطفيلية خلالها تتغذى على الدم وسوائل الأنسجة من الأسماك المضيف، وزيادة كتلة الجسم أكثر من 100 مرة . بعد 1،0-1،5 سنوات تتغذى على الأسماك المضيف في المحيط أو البحيرات الكبيرة، البالغين وقف التغذية في أوائل الربيع وتهاجر إلى الأنهار لتفرخ ثم يموت 1،2.

أثناء التحول، والكبد الجلكى البحر يفقد المرارة والشجرة الصفراوية بأكمله، وهو النمط الظاهري متحولة التطوري الذي يحاكي المرض الرضع الإنسان رتق القناة الصفراوية. رتق القناة الصفراوية الرضع هو مرض الكبد للأطفال نادرة مع مضاعفات طبية شديدة 4،5،6،7، 8،9،10، ولكن المرضية ومسببات رتق القناة الصفراوية غير معروفة إلى حد كبير 4. المرضى الذين يعانون من رتق القناة الصفراوية يموت في غضون عامين بعد الولادة ما لم يتم تنفيذ التدخل الجراحي (إجراء كاساي) 5. في وقت لاحق، هؤلاء المرضى تتطلب إدارة السريرية واسعة وغالبا ما زرع الكبد 6. لقد تم اقتراح العديد من النظريات من الصفراوي رتق etiopathogenesis، مثل العدوى الفيروسية، والتشوهات الخلقية، وأمراض المناعة الذاتية، وإهانة السامة. ومع ذلك، فإن مساهمة كل منهما في تطوير رتق القناة الصفراوية تظل غير حاسمة 7،8،9،10.

على عكس الأطفال الذين يعانون رتق القناة الصفراوية المرضية، الجلكى البحر الخضوع المبرمج تنمويا رتق القناة الصفراوية دون necroinflammation واسعة، والتليف أو التشمع 10. الحيوانات قد تعاني ركود صفراوي عابرة خلال هذه العملية 10، ولكن التكيف مع هذا الشرط التنمويةعبر دي نوفو التوليف وإفراز أملاح الصفراء في الأمعاء بعد رتق القناة الصفراوية التنموية، بالإضافة إلى الآليات المعروفة مثل الحد من التوليف الملح الصفراوية في الكبد 11. هذه العملية التنموية في الجلكى البحر يتيح الفرصة الوحيدة المعروفة لدراسة تطور رتق القناة الصفراوية.

وهناك طريقة المطورة حديثا يسمى "وضوح" تمكن التصوير ذات الدقة العالية في الجهاز العصبي لدى الثدييات المعقدة عن طريق تحويل أنسجة سليمة إلى هيدروجيل نانوية مسامية شفافة بصريا 12. باستخدام الكبد الجلكى البحر وبروتوكول تعديل وضوح، والتصوير أنسجة سليمة من انحطاط المرارية يمكن أن تكون موثقة في جميع أنحاء التحول الكبد.

Protocol

1. إعداد الحل

  1. جعل 1 L 10X 0.1 M العازلة الفوسفات المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4): وزن 26.2 فوسفات الصوديوم ز (أحادى)، 115 غ فوسفات الصوديوم (ثنائي القاعدة)، و87.66 غرام كلوريد الصوديوم. تذوب في حوالي 800 مل المقطر H 2 O، وضبط درجة الحموضة، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
    1. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4): خذ 100 مل 10X PBS، وإضافة 900 مل المقطر H 2 O.
    2. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات المالحة (درجة الحموضة 7.4) مع 0.1٪ تريتون X-100: خذ 100 مل 10X PBS، إضافة 1 مل تريتون X-100، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
  2. جعل 1 L 10X 0.1M العازلة الفوسفات (PB، ودرجة الحموضة 7.4): وزن 26.2 فوسفات الصوديوم ز (أحادى) و 115 غ فوسفات الصوديوم (ثنائي القاعدة). تذوب في حوالي 800 مل المقطر H 2 O، وضبط درجة الحموضة، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
    1. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4): خذ 100 مل 10X PB،وإضافة 900 مل المقطر H 2 O.
    2. جعل 1 L 0.1 M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) مع 0.1٪ تريتون X-100: خذ 100 مل 10X PB، إضافة 1 مل تريتون X-100، وجعل حجم ما يصل الى 1 لتر مع H 2 O. المقطر
  3. جعل حل 400 مل هيدروجيل مونومر (4٪ الأكريلاميد، 0.25٪ مكرر الأكريلاميد، 4٪ بارافورمالدهيد، فوق كبريتات الأمونيوم 0.0075٪، 0.0005٪ سابونين في 0.1 M PBS): وزن 0.3 غ فوق كبريتات الأمونيوم و 0.2 غرام سابونين. إضافة 210 مل المقطر H 2 O، 40 مل 40٪ الأكريلاميد، 10 مل 2٪ مكرر الأكريلاميد، 40 مل 10X PBS (درجة الحموضة 7.4)، و 100 مل 16٪ بارافورمالدهيد، وتخلط جيدا.
  4. جعل 4 L حل المقاصة (4٪ SDS في 0.2 M حمض البوريك): وزن 49.464 غرام حمض البوريك و160 غ SDS. تذوب في حوالي 3.5 L المقطر H 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 8.5 مع هيدروكسيد الصوديوم، وجعل حجم ما يصل الى 4 L.
  5. جعل 1 L 80٪ الحل الجلسرين: قياس 800 مل الجلسرين، إضافة 200 مل المقطر H 2 O، وتخلط جيدا.

2. تحضير الأنسجة

  1. إعداد هيدروجيل حل مونومر وقسامة 10 مل لكل 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
  2. تشريح الأنسجة كله وإصلاح في هيدروجيل لمدة 2 أيام في 4 درجات مئوية. تأكد من أن الحل هو هيدروجيل من 10X حجم الأنسجة على الأقل.
  3. إحضار الأنسجة هيدروجيل الثابتة (في 15 مل أنبوب الطرد المركزي) لغطاء الدخان.
  4. بلمرة الأنسجة الثابتة هيدروجيل بإضافة 5 ميكرولتر TEMED، وتخلط جيدا، وترك الجلوس في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 ساعة.
  5. إزالة هلام الزائدة بدقة. ملاحظة: سوف هلام إضافية تعيق عملية المقاصة واختراق الأجسام المضادة خلال تلطيخ.
  6. احتضان الأنسجة الثابتة في 10 مل الحل في تطهير شاكر حاضنة وضعت في 70 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لعدة أيام حتى يصبح الأنسجة شفافة. تغيير الحل تطهير مرة واحدة في اليوم على الأقل، وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل المقاصة.
  7. شطف الأنسجة في 10 مل 0.1 M PB مع 0.1٪ تريتون X-100 في 70 صمساء و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  8. احتضان الأنسجة أوضح في حل الأجسام المضادة الأولية في PB مع 0.1٪ تريتون X-100 على 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 2 ايام. ملاحظة: تأكد بما فيه الكفاية حل الأجسام المضادة الأولية لغمر النسيج كله.
  9. شطف الأنسجة في 10 مل PB مع 0.1٪ تريتون X-100 على 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  10. نفذ الخطوات التالية في غرفة مظلمة أو تحت ضوء خافت. تغطية العينات مع احباط لمنع تبييض الصورة.
  11. احتضان الأنسجة أوضح مع الفلورسنت حل الضد الثانوية في PB مع 0.1٪ تريتون X-100 و المصل حجب في 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
  12. شطف الأنسجة في 10 مل PB مع 0.1٪ تريتون X-100 على 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام و الزائدةROM الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  13. شطف الأنسجة في 10 مل PBS في 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل. كرر هذه الخطوة 3 مرات وإزالة هلام الزائدة من الأنسجة عند تغيير الحل العازلة.
  14. احتضان الأنسجة أوضح في الجلسرين 80٪ في 70 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية خلال الليل.
  15. تخزين الأنسجة الملون فلوري في 4 درجات مئوية قبل المجهري متحد البؤر.

النتائج

تحدث العديد من الفعاليات التنموية الهامة في النظام الكبد خلال البحر الجلكى التحول. القناة الصفراوية والمرارة الخضوع لموت الخلايا المبرمج والمنحطة (الشكل 1). الجمع بين أسلوب التوضيح تعديل وتلطيخ مع الكبد علامة الخلية cytokeratin 19 (CK19، موجودة في كل خلايا الكبد وchol...

Discussion

يتم تعديل هذا البروتوكول من أسلوب جديد يسمى "وضوح" 12، التي crosslinks الأنسجة سليمة مع بولكرلميد لتشكيل هيدروجيل نانوية مسامية، ثم يجرد بعيدا غشاء البلازما من الأنسجة لتحقيق الشفافية البصرية ونفاذية الجزيئات. "وضوح" يسمح التصوير أنسجة سليمة من الإسقاط طو...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

والكتاب يعترف مساهمة محطة البيولوجية هاموند خليج، مركز العلوم البحيرات الكبرى، المسح الجيولوجي الامريكية. نشكر أيضا الدكتور الإطار ميليندا في مركز متقدم المجهر في جامعة ولاية ميشيغان لها الدعم التقني في المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. ويدعم هذه الدراسة من المنح المقدمة من هيئة مصايد أسماك البحيرات الكبرى إلى YWCD وWML.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamide Bio-Rad161-0140
2% bis-acrylamide Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
ammonium persulfate SigmaA3678-25G
boric acidSigmaB7901-1KG
saponin Sigma47036
sodium dodecyl sulfate SigmaL337-500G
sodium phosphate (monobasic)Sigma04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
glycerol SigmaG9012-500ML
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences15710-S
NaOH pellets EMDSX0590-3
15 ml centrifuge tubesAny brand
dissecting tools Any brand

References

  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88 Petromyzon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved