바다 칠성 장어의 간 변태 동안 담즙의 퇴보를 시각화하는 새로운 방법 명확화 ( Petromyzon 스 marinus)

요약

바다 칠성 장어는 변태 동안 담낭 및 담관, 인간의 담도 폐쇄증과 유사한 과정을 잃게됩니다. 새로운 고정 및 정화 방법 (CLARITY)은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 전체 담도 트리를 시각화하기 위해 수정되었다. 이 방법은 담즙의 변성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

초록

담도 폐쇄증 대만에서 5000에있는보고 된 주파수 추정 1 15,000 미국 남동부에있는 주파수,하지만 동아시아 국가에서 일반적으로, 초기 단계의 희귀 질환이다. 많은 부분이 담도 폐쇄증의 관리에 대한 알려져 있지만, 그 기전은 아직 애매하다. 바다 칠성 장어 (Petromyzon의 스 marinus)는 담즙의 변성의 기전 및 진행 상황을 검사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 유충, 기생, 성인 : 바다 칠성 장어는 세 개의 서로 다른 삶의 단계를 통해 개발. 유충에서 기생 청소년으로 전환하는 동안, 바다 칠성 장어는 외부 형태와 내부 장기의 극적인 개편과 개조와 변형을 받고있다. 간, 전체 담즙의 시스템은 담낭과 담도 나무를 포함하여, 손실됩니다. "CLARITY"라는 새로 개발 된 방법은 변성 바다 칠성 장어의 장과 전체 간 접합을 명확히하기 위해 수정되었습니다.담즙의 변성의 과정은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 시각과 바다 칠성 장어 변태시 식별되었다. 이 방법은 고유 한 동물 모델에서 담도 폐쇄증을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

서문

바다 칠성 장어 세 가지 생활을 통해 개발 ^1,2 단계입니다. 애벌레 바다 칠성 장어 (L)의 저서 필터 피더로 굴에서 대부분의 시간을 보낸다. 외부 형태와 내부 장기 ³ 개편에 극적인 변화의 일곱 변성 단계를 거쳐, 그 결과 청소년 (JV)는 질량 100 회 이상 몸을 증가, 그들이 호스트 물고기의 혈액과 조직 유체에 공급되는 동안의 기생 단계를 입력 . 바다 나 큰 호수에있는 호스트 물고기에 먹이 1.0-1.5 년 후, 성인은 이른 봄에 동안 수유를 중단하고 산란 하천으로 마이그레이션 한 ^{후, 2 다이.}

변형하는 동안, 바다 칠성 장어의 간은 담즙 방광 및 전체 담즙 나무, 인간의 유아 질환 담도 폐쇄증을 모방 진화 돌연변이 표현형을 잃는다. 유아 담도 폐쇄증은 ^4,5,6,7 심각한 의료 합병증이 드문 소아 간 질환입니다, 8,9,10 그러나 담도 폐쇄증의 발병 기전과 원인 ⁴ 대부분 알 수 있습니다. 외과 적 수술 (카사이 절차가) ^5를 수행하지 않는 담도 폐쇄증 환자는 출생 후 2 년 이내에 사망합니다. 그 후,이 환자는 광범위한 임상 관리 및 자주 간 이식 ^{6이 필요합니다.} 담도 폐쇄증의 병인의 많은 이론은 바이러스 성 감염, 선천성 기형, 면역 질환, 독성 모욕으로 제안되었다. 그러나, 담도 폐쇄증의 발전에 각각의 기여는 ^7,8,9,10 결정적이 남아있다.

병적 인 담도 폐쇄증 고통을 유아는 달리, 바다 칠성 장어는 발달 광범위한 necroinflammation, 섬유증 또는 간경변 ¹⁰ 않고 담도 폐쇄증을 프로그램 받고있다. 동물이 과정 ^10시 과도 담즙을 경험하지만,이 발달 상태에 적응할 수있다를 통해 새로이 합성과 같은 간 ¹¹ 담즙산 합성의 감소로 알려진 메커니즘뿐만 아니라 개발 담도 폐쇄증, 후 소장에서 담즙 소금의 분비. 바다 칠성 장어에서이 발달 과정은 담도 폐쇄증의 진행을 검토 할 수있는 유일한 알려져있는 기회를 제공합니다.

"CLARITY"라는 새로 개발 된 방법은 광학적으로 투명한 나노 다공성 하이드로 겔 ^(12)로 그대로 조직을 변형하여 복잡한 포유 동물의 신경계에 높은 해상도의 영상을 가능하게합니다. 바다 칠성 장어의 간 및 수정 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 담즙 변성 그대로 - 조직 영상은 간 변형을 통해 설명 할 수있다.

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프로토콜

1. 솔루션 준비

1. 1 L 만들기 10X 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4의) : 26.2 g 인산 나트륨 (일 염기성), 115g의 인산 나트륨 (이염 기성) 및 87.66 g의 염화나트륨을 단다. 약 800 ml의 증류수에 용해 H ₂ O, 산도를 조정하고, 증류수 H ₂ O로 1 L에 볼륨을 가져
   1. 1 L 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (산도 7.4) 제조 업체 : 100 ML 10X PBS를 가지고, 900 ㎖의 증류수 H ₂ O를 추가
   2. 100 ㎖의 10 배 PBS를 타고, 1 ㎖ 트리톤 X-100을 추가하고, 증류수 H ₂ O로 1 L까지의 볼륨을 가지고 : 1 L 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (산도 7.4) 0.1 % 트리톤 X-100을
2. 26.2 g 인산 나트륨 (염기)과 115g 인산 나트륨 (이염을) 무게 : 1 L 배의 0.1M 인산 버퍼 (PB, 산도 7.4)을 확인합니다. 약 800 ml의 증류수에 용해 H ₂ O, 산도를 조정하고, 증류수 H ₂ O로 1 L에 볼륨을 가져
   1. 1 L 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 제조 업체 : 타고 100 ㎖의 10 배의 PB,와 H ₂ O를 증류수 900 ㎖에 추가
   2. 0.1 % 트리톤 X-100 1 L 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 제조 업체 : 100 ㎖의 10 배의 PB를 타고, 1 ㎖ 트리톤 X-100을 추가하고, 증류수 H ₂ O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게
3. 400 ㎖의 하이드로 겔 단량체 용액 (4 % 아크릴 아미드, 0.25 % 비스 - 아크릴 아미드, 4 % 파라 포름 알데히드, 0.0075 %의 황산 암모늄, 0.1 M PBS에 0.​​0005 %의 사포닌을) 확인 : 0.3 g과 황산 암모늄 0.2 g 사포닌의 무게. 210 ㎖의 증류수 H _{2 O를} 추가, 40 ㎖의 40 % 아크릴, 10 ㎖ 2 % 비스 - 아크릴 아미드, 40 ㎖의 10 배 PBS (산도 7.4), 100 ml의 16 % 파라 포름 알데히드, 잘 섞는다.
4. (0.2 M 붕산 4 % SDS) 4 L 청산 솔루션을 만들기 : SDS G 49.464 g 붕산 160의 무게를 측정. 약 3.5 L 소주 H ₂ O에 용해 NaOH로 pH가 8.5가되도록 조정하고, 4 L.에 볼륨을 가져
5. 1 L 80 % 글리세롤 솔루션을 만들 : 800 ml의 글리세롤을 측정 200 ㎖의 증류수 H ₂ O를 추가하고 잘 섞는다.

2. 조직 준비

1. 각 15 ㎖의 원심 분리기 튜브 하이드로 겔 단량체 용액과 나누어지는 10 ㎖를 준비합니다.
2. 전체 조직을 해부하고 4 ℃에서 2 일간 하이드로 겔 해결 하이드로 겔 솔루션은 적어도 10 배 조직의 볼륨이 있는지 확인하십시오.
3. 흄 후드 (15 ML의 원심 분리기 튜브) 하이드로 겔 고정 된 조직을 가지고.
4. , TEMED 5 μl를 추가하여 하이드로 겔 고정 된 조직을 중합 잘 섞어, 2 ~ 3 시간 동안 실온에서 흄 후드에 앉아 보자.
5. 철저하게 초과 젤을 제거합니다. 주의 : 여분 겔 염색시 정산 과정과 항체의 침투를 방해 할 것이다.
6. 조직이 투명하게 될 때까지 몇 일 동안 70 rpm으로 50 ° C로 설정 인큐베이터 통에 솔루션을 취소 10 ㎖에 고정 된 조직을 품어. 적어도 하루에 한 번 청소 솔루션을 변경하고 청소 솔루션을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
7. 70 실온에서 0.1 % 트리톤 X-100 10 ㎖ 0.1 M PB에서 조직을 헹구오후 37 ° C에서 하룻밤. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
8. 2 일간 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100와 함께 PB의 기본 항체 솔루션 명확히 조직을 품어. 참고 : 전체 조직을 물속에 충분한 기본 항체 솔루션을합니다.
9. 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100과 10 ㎖의 PB의 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
10. 어두운 실내 나 어두운 곳에서 다음 단계를 수행합니다. 사진 표백을 방지하기 위해 호일로 샘플을 커버.
11. 0.1 % 트리톤 X-100와 PB의 형광 차 항체 용액 1 일 동안 70 rpm으로 37 ° C에서 차단 혈청 정화 된 조직을 품어.
12. 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100과 10 ㎖의 PB의 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 과잉 젤 F를 제거완충액을 변경할 때 티슈 롬.
13. 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 10 ㎖ PBS에서 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
14. 70 rpm으로 37 ° C에서 하룻밤에 80 % 글리세롤에 명확히 조직을 품어.
15. 이전의 공 초점 현미경에 4 ° C에서 형광 스테인드 조직을 저장합니다.

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결과

몇 가지 중요한 발달 이벤트는 바다 칠성 장어 변태 동안 간담에서 발생합니다. 담관 및 담낭 세포 사멸과 퇴화 (그림 1)를 받고있다. 및 공 초점 현미경을 사용하여 항 세포 사멸 마커 Bcl2의 (cholangiocytes 및 간세포 이전과 변형 ¹³ 후 모두에 존재 CK19) 간 세포 마커 아세포 (19) 수정 된 설명 방법과 염색을 결합, 전체 담즙의 시스템은 Z 축 (함께 체포됐다 그림 2)와 3 ?...

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토론

이 프로토콜은 나노 다공성 겔을 형성하기 위해 폴리 아크릴 아미드와 손상 조직을 가교 결합하고 광학 투명성 고분자 투과성을 달성하기 위해 조직의 세포막을 얻어 스트립 ^{"CLARITY"(12)라고하는} 새로운 방법에서 수정된다. "CLARITY는"장거리 투사와 신경계에있는 지역의 회로 배선의 손상 -​​ 조직 이미징을 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 변태 중에 바다 칠성 장어 간 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G
boric acid	Sigma	B7901-1KG
saponin	Sigma	47036
sodium dodecyl sulfate	Sigma	L337-500G
sodium phosphate (monobasic)	Sigma	04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glycerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
NaOH pellets	EMD	SX0590-3
15 ml centrifuge tubes	Any brand
dissecting tools	Any brand