Un metodo Chiarimento Nuovo per visualizzare biliare degenerazione Durante fegato Metamorfosi in mare Lamprey ( Petromyzon marinus)

Riepilogo

Lampreda di mare perde la cistifellea e vie biliari durante la metamorfosi, un processo simile a atresia biliare umano. Un nuovo metodo di fissazione e chiarificazione (CLARITY) è stato modificato per visualizzare l'intero albero biliare mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la degenerazione biliare.

Abstract

Atresia biliare è una rara malattia dell'infanzia, con una stima di 1 a 15.000 frequenza nel sud-est degli Stati Uniti, ma più comune nei paesi dell'Asia orientale, con una frequenza riportata di 1 su 5.000 in Taiwan. Anche se si sa molto circa la gestione di atresia biliare, la sua patogenesi è ancora sfuggente. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) offre un'opportunità unica per esaminare il meccanismo e la progressione della degenerazione biliare. Lampreda di mare sviluppare attraverso tre fasi della vita distinte: larve, parassiti, e adulti. Durante la transizione da larve di parassiti giovanile, lampreda di mare subiscono metamorfosi con la riorganizzazione drammatica e rimodellamento in morfologia esterna e gli organi interni. Nel fegato, l'intero sistema biliare è perso, compresa la cistifellea e l'albero biliare. Un metodo di nuova concezione denominato "CHIAREZZA" è stata modificata per chiarire l'intero fegato e il bivio con l'intestino in metamorfico lampreda di mare. Ilprocesso di degenerazione biliare è stato visualizzato e discernimento durante la lampreda di mare metamorfosi mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare atresia biliare in un modello animale unico.

Introduzione

Lampreda di mare si sviluppano attraverso tre distinte fasi di vita di ^1,2. Larvale lampreda di mare (L) trascorrono più tempo in tane come filtratori bentonici. Dopo aver attraversato sette stadi metamorfici di drammatici cambiamenti nella morfologia e riorganizzazione in organi interni ³ esterni, il novellame risultanti (JV) entrano in una fase parassitaria nel corso della quale si nutrono di sangue e fluidi tissutali di pesce ospitante, l'aumento della massa corporea più di 100 volte . Dopo la 1.0 to 1,5 anni di alimentazione sul pesce ospite in mare o grandi laghi, adulti cessano alimentazione durante la primavera e migrano nei fiumi per deporre le uova e poi muoiono ^1,2.

Durante la metamorfosi, il fegato lampreda di mare perde la cistifellea e l'intero albero biliare, un fenotipo mutante evolutivo che imita la malattia neonato umano atresia delle vie biliari. Infant atresia biliare è una rara malattia del fegato pediatrico a gravi complicazioni mediche ^4,5,6,7, 8,9,10, ma la patogenesi ed eziologia di atresia biliare sono in gran parte sconosciuti ^4. I pazienti con atresia biliare muoiono entro due anni dopo la nascita se non viene eseguito l'intervento chirurgico (procedura Kasai) ^5. Successivamente, questi pazienti richiedono una gestione clinica e spesso trapianto di fegato ^6. Molte teorie di atresia biliare eziopatogenesi sono stati proposti, come l'infezione virale, malformazione congenita, malattia autoimmune, e insulto tossico. Tuttavia, il contributo di ciascuno allo sviluppo di atresia biliare rimane inconcludente ^7,8,9,10.

A differenza dei bambini che soffrono patologico atresia delle vie biliari, lampreda di mare che formano oggetto evolutivamente programmato atresia delle vie biliari senza una necroinfiammazione, fibrosi o cirrosi ^10. Gli animali possono soffrire colestasi transitorio durante questo processo ^10, ma adattarsi a questa condizione dello sviluppovia de novo sintesi e secrezione di sali biliari nell'intestino dopo sviluppo atresia biliare, oltre ai meccanismi noti come la riduzione della sintesi di sali biliari nel fegato ^11. Questo processo di sviluppo in lampreda di mare offre l'opportunità unica nota di esaminare la progressione di atresia biliare.

Un metodo di nuova concezione denominato "CHIAREZZA" permette di imaging ad alta risoluzione in complessi sistemi nervosi dei mammiferi trasformando tessuto intatto in un idrogel nanoporosa otticamente trasparente ^12. Utilizzando mare fegato lampreda e un protocollo CLARITY modificato, imaging intatto tessuto della degenerazione biliare può essere documentata in tutta metamorfosi fegato.

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Protocollo

1. Preparazione Solution

1. Rendere 1 L 10x 0.1 M salina tampone fosfato (PBS, pH 7,4): Pesare 26,2 g di fosfato di sodio (monobasico), 115 g di fosfato di sodio (bibasico), e 87,66 g NaCl. Sciogliere in circa 800 ml di acqua distillata H ₂ O, regolare il pH, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H ₂ O.
   1. Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato salino (pH 7.4): Prendete 100 ml 10x PBS e aggiungere 900 ml di acqua distillata H ₂ O.
   2. Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato salino (pH 7.4) con 0.1% Triton X-100: Prendete 100 ml 10x PBS, aggiungere 1 ml di Triton X-100, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H ₂ O.
2. Rendere 1 L 10x 0.1M tampone fosfato (PB, pH 7,4): Pesare 26,2 g di fosfato di sodio (monobasico) e 115 g di fosfato di sodio (bibasico). Sciogliere in circa 800 ml di acqua distillata H ₂ O, regolare il pH, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H ₂ O.
   1. Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato (pH 7.4): Prendete 100 ml 10x PB,e aggiungere 900 ml di acqua distillata H ₂ O.
   2. Rendere 1 L 0.1 M tampone fosfato (pH 7.4) con 0.1% Triton X-100: Prendete 100 ml 10x PB, aggiungere 1 ml di Triton X-100, e portare al volume di 1 litro con acqua distillata H ₂ O.
3. Preparare la soluzione di 400 ml di idrogel monomero (4% acrilammide, 0,25% bis-acrilammide, 4% paraformaldeide, 0,0075% persolfato di ammonio, 0,0005% saponina in 0.1 M PBS): Pesare 0,3 g di persolfato di ammonio e 0,2 g saponina. Aggiungere 210 ml di H ₂ O distillata, 40 ml 40% di acrilammide, 10 ml 2% bis-acrilammide, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml 16% paraformaldeide, e mescolare bene.
4. Preparare la soluzione di compensazione 4 L (4% SDS in acido borico 0.2 M): Pesare 49,464 g di acido borico e 160 g SDS. Sciogliere in circa 3,5 L H ₂ O distillata, aggiustare il pH a 8.5 con NaOH, e portare il volume fino a 4 L.
5. Rendere 1 L soluzione di glicerolo 80%: Misurare 800 ml di glicerolo, aggiungere 200 ml di acqua distillata H ₂ O, e mescolare bene.

2. Preparazione Tissue

1. Preparare la soluzione di monomero idrogel e un'aliquota di 10 ml per ogni provetta da centrifuga 15 ml.
2. Sezionare tutto il tessuto e fissare l'idrogel per 2 giorni a 4 ° C. Assicurarsi che la soluzione idrogel è almeno 10 volte il volume del tessuto.
3. Portare il tessuto fissato idrogel (nella provetta da centrifuga 15 ml) ad una cappa aspirante.
4. Polimerizzare il tessuto fissato idrogel con l'aggiunta di 5 ml TEMED, mescolare bene e lasciar riposare nella cappa a temperatura ambiente per 2-3 ore.
5. Rimuovere accuratamente il gel in eccesso. Nota: gel Extra ostacolerà il processo di compensazione e la penetrazione degli anticorpi durante la colorazione.
6. Incubare il tessuto fissato in 10 ml di soluzione di compensazione in un agitatore incubatore a 70 rpm e 50 ° C per diversi giorni finché il tessuto diventa trasparente. Cambiare soluzione compensazione almeno una volta al giorno e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione di compensazione.
7. Risciacquare il tessuto in 10 ml di 0,1 M PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
8. Incubare il tessuto chiarito nella soluzione di anticorpo primario in PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C per 2 giorni. Nota: soluzione di anticorpo primario sufficiente a sommergere tutto il tessuto.
9. Risciacquare il tessuto in 10 ml PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
10. Effettuare le seguenti operazioni in una stanza buia o sotto la luce fioca. Coprire i campioni con un foglio per evitare foto sbiancamento.
11. Incubare il tessuto chiarito con la soluzione di anticorpo secondario fluorescente in PB con 0.1% Triton X-100 e il siero di blocco a 70 rpm e 37 ° C per 1 giorni.
12. Risciacquare il tessuto in 10 ml PB con 0.1% Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questa operazione 3 volte e rimuovere il gel in eccesso fROM il tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
13. Risciacquare il tessuto in 10 ml di PBS a 70 rpm e 37 ° C durante la notte. Ripetere questo passaggio 3 volte e rimuovere il gel in eccesso dal tessuto quando si cambia la soluzione tampone.
14. Incubare il tessuto chiarito in 80% glicerolo a 70 rpm e 37 ° C durante la notte.
15. Conservare il tessuto tinto fluorescente a 4 ° C prima di microscopia confocale.

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Risultati

Diversi importanti eventi evolutivi si verificano nel sistema epatobiliare durante la lampreda di mare metamorfosi. Il dotto biliare e la cistifellea apoptosi e degenerata (Figura 1). Combinando il metodo chiarimento modificato e colorazione con fegato marker delle cellule citocheratina 19 (CK19, presente in entrambi i colangiociti ed epatociti prima e dopo la metamorfosi ¹³⁾ e anti-apoptotica Bcl2 marcatore utilizzando la microscopia confocale, l'intero sistema biliare è stato catturato...

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Discussione

Questo protocollo è modificato da un nuovo metodo chiamato "chiarezza" ^12, che reticola tessuto intatto con poliacrilammide per formare un idrogel nanoporoso, e poi strappa via la membrana plasmatica del tessuto per ottenere la trasparenza ottica e permeabilità macromolecolare. "CHIAREZZA" permette l'imaging intatto tessuto di lungo raggio di proiezione e il cablaggio del circuito locale nel sistema nervoso. Questo nuovo metodo può essere usato per visualizzare l'intero sistema ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G
boric acid	Sigma	B7901-1KG
saponin	Sigma	47036
sodium dodecyl sulfate	Sigma	L337-500G
sodium phosphate (monobasic)	Sigma	04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glycerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
NaOH pellets	EMD	SX0590-3
15 ml centrifuge tubes	Any brand
dissecting tools	Any brand