JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

צמד ים הים לאבד את כיס מרה ודרכי מרה במטמורפוזה, תהליך דומה לatresia מרה האנושי. קיבעון חדש ושיטת הבהרה (CLARITY) שונה כדי להמחיש את עץ המרה כולו באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור ניוון מרה.

Abstract

atresia מרה הוא מחלה נדירה של ינקות, עם 1 ב15,000 תדירות מוערכת בארצות הברית דרום מזרח, אך נפוצה יותר במדינות מזרח אסיה, עם תדירות מדווחת של 1 ב5,000 בטייוואן. למרות שהרבה ידוע על ניהול atresia מרה, פתוגנזה שלה היא עדיין חמקמקה. צמד ים הים (מרינוס Petromyzon) מספק הזדמנות ייחודית לבחון את המנגנון והתקדמות של ניוון מרה. צמד ים הים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים: זחל, טפיל, ומבוגרים. במהלך המעבר מזחלים לנוער טפיל, צמד ים הים עובר מטמורפוזה עם ארגון מחדש דרמטי ושיפוץ במורפולוגיה חיצונית ואיברים פנימיים. בכבד, מערכת המרה כולו הולכת לאיבוד, ובם כיס המרה ועץ המרה. שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" שונה כדי להבהיר את כל הכבד והצומת עם המעי בצמד ים ים מותמרים.התהליך של ניוון מרה היה דמיינו ולהבחין במטמורפוזה צמד ים ים באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור atresia מרה במודל של בעלי חיים ייחודיים.

Introduction

צמד ים ים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים 1,2. צמד ים הזחל ים (L) מבלה את רוב הזמן במחילות כמו מתקני האכלת מסנן של קרקעית ים. לאחר שעובר שבעה שלבים מותמרים של שינויים דרמטיים במורפולוגיה וארגון מחדש באיברים פנימיים 3 חיצוניים, וכתוצאה מכך בני הנוער (JV) להיכנס לשלב טפיל שבמהלכו הם ניזונים דם ונוזלי רקמה מדג מארח, להגדיל את מסת הגוף יותר מ 100 פעמים . לאחר 1.0-1.5 שנות האכלה על דגי המארח בים או אגמים גדולים, מבוגרים להפסיק האכלה בתחילת האביב ונודדים לתוך נהרות כדי להשריץ ואז למות 1,2.

במהלך המטמורפוזה, כבד צמד ים הים מאבד את כיס מרה ועץ המרה כולו, פנוטיפ מוטנטי אבולוציוני המחקה את atresia המרה מחלת תינוק האנושי. atresia מרה תינוקות הוא מחלת כבד נדירה בילדים עם סיבוכים רפואיים קשים 4,5,6,7, 8,9,10, לעומת זאת פתוגנזה ואטיולוגיה של atresia המרה אינן ידועות ברוב 4. חולים עם אטרזיה המרה למות בתוך שנתיים לאחר לידה, אלא אם כן התערבות כירורגית (הליך קסאי) מתבצעת 5. כתוצאה מכך, חולים אלה מחייבים ניהול נרחב קליני ולעתים קרובות השתלה כבד 6. תאוריות של etiopathogenesis atresia מרה רבות הוצעו, כגון זיהום ויראלי, מומים מולדים, מחלות אוטואימוניות, ועלבון רעיל. עם זאת, תרומתו של כל לפיתוחה של atresia המרה נשארת חד משמעית 7,8,9,10.

בניגוד לתינוקות שסובלים atresia המרה פתולוגי, צמד ים הים לעבור בחינה התפתחותית מתוכנת atresia מרה ללא necroinflammation נרחב, סיסטיק או שחמת 10. בעלי החיים עלולים לסבול cholestasis חולפת במהלך תהליך זה 10, אבל להסתגל למצב ההתפתחותי הזהבאמצעות דה נובו סינתזה והפרשה של מלחי מרה במעי לאחר atresia מרה התפתחותי, בנוסף למנגנונים ידועים כגון הפחתה של סינתזת מלח מרה בכבד 11. תהליך התפתחותי זה בצמד ים ים מספק את ההזדמנות היחידה הידועה כדי לבחון את ההתקדמות של atresia מרה.

שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה במערכות עצבים של יונקים מורכבים על ידי הפיכת רקמות שלמות להידרוג'ל nanoporous השקוף אופטי 12. שימוש בכבד צמד ים ים ופרוטוקול CLARITY שונה, הדמיה בשלמות רקמות של ניוון מרה יכולה להיות מתועדת לאורך המטמורפוזה כבד.

Protocol

1. פתרון הכנה

  1. הפוך L 1 10x 0.1 M חיץ מלוח פוספט (PBS, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic), 115 פוספט נתרן g (dibasic), ו87.66 NaCl גרם. ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
    1. הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר 10x PBS, ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O.
    2. הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 מיליליטר 10x PBS, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
  2. הפוך חיץ L 1 0.1M 10x פוספט (PB, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic) ו115 פוספט נתרן g (dibasic). ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
    1. הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר PB 10x,ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O.
    2. הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 PB 10x מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
  3. הפוך פתרון מונומר הידרוג'ל 400 מיליליטר (acrylamide 4%, 0.25% bis-acrylamide, paraformaldehyde 4%, 0.0075% persulfate אמוניום, saponin 0.0005% ב0.1 M PBS): לשקול 0.3 persulfate אמוניום גרם ו0.2 saponin גרם. הוספת 210 מיליליטר מזוקק H 2 O, acrylamide 40 מיליליטר 40%, 10 מיליליטר 2% bis-acrylamide, 40 מיליליטר 10x PBS (pH 7.4), 100 מיליליטר paraformaldehyde 16%, ומערבבים היטב.
  4. הפוך פתרון 4 L סליקה (4% SDS בחומצה בור 0.2 ז): לשקול 49.464 חומצה בור גרם ו160 גרם SDS. ממיסים בH על 3.5 L מזוקק 2 O, כדי להתאים את pH 8.5 עם NaOH, ולהביא את הנפח עד 4 L.
  5. הפוך פתרון גליצרול 80% L 1: מדוד גליצרול 800 מיליליטר, להוסיף 200 מיליליטר מזוקק H 2 O, ומערבבים היטב.

2. הכנת רקמה

  1. הכן פתרון הידרוג'ל מונומר וaliquot 10 מיליליטר לכל צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
  2. לנתח את כל הרקמות ולתקן בהידרוג'ל ל2 ימים ב 4 ° C. ודא כי פתרון הידרוג'ל הוא לפחות 10x הנפח של הרקמה.
  3. תביא את רקמות הידרוג'ל הקבועים (בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר) למכסת מנוע קטר.
  4. פלמר הרקמות קבועות הידרוג'ל ידי הוספת 5 μl TEMED, לערבב היטב, ולתת לשבת במנדף בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שעות.
  5. הסר את הג'ל העודף ביסודיות. הערה: ג'ל במיוחד יהיה לעכב את תהליך הסליקה וחדירת הנוגדנים במהלך מכתים.
  6. דגירה הרקמות קבועות ב10 מיליליטר ניקוי פתרון שבייקר אינקובטור נקבעו על 70 סל"ד ו50 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד שהרקמה הופכת שקופה. שינוי פתרון ניקוי לפחות פעם ביום ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון הסליקה.
  7. יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר 0.1 M PB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 rבערב, ו37 ° C במשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
  8. דגירה הרקמה הבהירה בפתרון הנוגדן הראשוני בPB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. שים לב: להפוך את פתרון נוגדן ראשוני מספיק כדי להטביע את כל הרקמות.
  9. יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
  10. בצע את השלבים הבאים בחדר חשוך או תחת אור עמום. כסה את הדגימות עם נייר כסף כדי למנוע הלבנת צילום.
  11. דגירה הרקמה הבהירה עם פתרון הניאון המשני נוגדנים בPB עם 0.1% טריטון X-100 וסרום החסימה ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס במשך יום 1.
  12. יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את f ג'ל העודפתrom הרקמה בעת שינוי פתרון החיץ.
  13. יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר PBS ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
  14. דגירה הרקמה הבהירה בגליצרול 80% ב70 סל"ד ו37 לילה מעלות צלזיוס.
  15. אחסן את הרקמה הצבעונית הניאון על 4 מעלות צלזיוס לפני מיקרוסקופיה confocal.

תוצאות

אירועים התפתחותיים חשובים כמה להתרחש במערכת של כיס המרה במהלך המטמורפוזה צמד ים לים. צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס ומנוון (איור 1). שילוב של שיטת ההבהרה שונה וצביעה עם cytokeratin כבד סמן תא 19 (CK19, בהווה בשני cholangiocytes וhepatocytes לפני ואחרי מטמורפוזה 13) וBCL2 ...

Discussion

פרוטוקול זה הוא שונה משיטה חדשה הנקראת "בהירות" 12, שCrosslinks רקמות שלמות עם polyacrylamide כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous, ולאחר מכן רצועות מן קרום הפלזמה של הרקמה כדי להשיג שקיפות אופטית וחדירות macromolecular. "בהירות" מאפשרת הדמיה בשלמות רקמות של השלכה ארוך טווח וחיווט ...

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לתרומה של מפרץ המונד ביולוגי תחנה, אגמי מרכז מדע גדול, גיאולוגי אמריקאי. אנו מודים גם למסגרת ד"ר מלינדה במרכז למיקרוסקופי מתקדם באוניברסיטת מדינת מישיגן לתמיכה הטכנית שלה במיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת דיג האגמים הגדולים לYWCD ו-WML.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamide Bio-Rad161-0140
2% bis-acrylamide Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
ammonium persulfate SigmaA3678-25G
boric acidSigmaB7901-1KG
saponin Sigma47036
sodium dodecyl sulfate SigmaL337-500G
sodium phosphate (monobasic)Sigma04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
glycerol SigmaG9012-500ML
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences15710-S
NaOH pellets EMDSX0590-3
15 ml centrifuge tubesAny brand
dissecting tools Any brand

References

  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88atresiaPetromyzon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved