Eine neue Methode zur Klärung biliäre Leberdegeneration Visualisieren Während Metamorphosis in Seeneunauge ( Petromyzon marinus)

Zusammenfassung

Meerneunauge verlieren die Gallenblase und der Gallenwege während der Metamorphose, ein Prozess ähnlich dem menschlichen Gallengangsatresie. Eine neue Methode der Fixierung und Klärung (CLARITY) wurde modifiziert, um die Gallenwege mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisieren. Diese Methode bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Gallen Degeneration zu studieren.

Zusammenfassung

Gallengangsatresie ist eine seltene Erkrankung des Kindesalters, mit einem geschätzten 1 in 15000 Frequenz im Südosten der Vereinigten Staaten, sondern in ostasiatischen Ländern häufiger mit einer Frequenz von 1 berichtet in 5000 in Taiwan. Obwohl viel über die Verwaltung der Gallengangsatresie bekannt ist, ist der Pathogenese noch ungeklärt. Das Meerneunauge (Petromyzon marinus) bietet eine einzigartige Gelegenheit, um den Mechanismus und den Verlauf von Gallendegeneration zu untersuchen. Meerneunauge entwickeln sich durch drei verschiedene Lebensphasen: Larven, Parasiten und Erwachsenen. Während des Übergangs von Larven von parasitären Jugend, Meerneunauge Metamorphose zu unterziehen mit dramatischen Sanierung und Umbau in äußere Morphologie und inneren Organen. In der Leber wird die gesamte Gallensystems verloren, einschließlich der Gallenblase und der Gallenwege. Eine neu entwickelte Methode namens "Klarheit" wurde modifiziert, um die gesamte Leber und die Kreuzung mit dem Darm in metamorphen Meerneunauge zu klären. DieProzess der Gallen Degeneration wurde durch Verwendung konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert und Meerneunauge während der Metamorphose zu erkennen. Diese Methode bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Gallengangsatresie in einer einzigartigen Tiermodell zu untersuchen.

Einleitung

Meerneunauge durch drei verschiedene Leben zu entwickeln Stufen ^1,2. Larven Meerneunauge (L) verbringen die meiste Zeit in Höhlen benthische Filtrierer. Nachdem man durch sieben metamorphen Phasen der dramatischen Veränderungen in der Morphologie und äußere Umgestaltung in die inneren Organe ^3, die daraus resultierenden Jugendliche (JV) geben eine parasitäre Phase, während der sie auf Blut-und Gewebeflüssigkeiten von Host-Fische zu füttern, die Erhöhung der Körpermasse mehr als 100 Mal . Nach 1,0 bis 1,5 years Fütterung auf die Wirtsfische im Meer oder großen Seen, Erwachsene aufhören Fütterung während des Frühjahrs und wandern zum Laichen in die Flüsse und dann sterben ^1,2.

Während der Metamorphose, verliert das Meerneunauge Leber die Gallenblase und der Gallenwege, eine evolutionäre mutierten Phänotyp, die den menschlichen Säugling Krankheit Gallengangsatresie nachahmt. Infant Gallengangsatresie ist eine seltene pädiatrische Lebererkrankung mit schweren medizinischen Komplikationen ^4,5,6,7, 8.9.10, aber die Pathogenese und Ätiologie der Gallengangsatresie sind weitgehend unbekannt ^4. Patienten mit Gallengangsatresie sterben innerhalb von zwei Jahren nach der Geburt, wenn ein chirurgischer Eingriff (Kasai-Verfahren) durchgeführt wird ^5. Anschließend werden diese Patienten erfordern umfangreiche klinische Behandlung und oft eine Lebertransplantation ^sechs. Viele Theorien Gallenatresie Etiopathogenese vorgeschlagen worden, wie virale Infektionen, kongenitale Fehlbildungen, Autoimmunerkrankungen und toxischen Insult. Allerdings bleibt der Beitrag der jeweils für die Entwicklung der Gallengangsatresie nicht schlüssig ^7,8,9,10.

Im Gegensatz zu Kindern, die pathologische Gallengangsatresie leiden, unterziehen Meerneunauge entwicklungs programmiert Gallengangsatresie ohne umfangreiche necroinflammation, Fibrose oder Zirrhose ^10. Die Tiere können vorübergehende Cholestase während dieses Prozesses ¹⁰ leiden, aber passen sich diesem Entwicklungszustanddurch de novo-Synthese und Sekretion von Gallensäuren im Darm nach der Entwicklungs biliäre Atresie, zusätzlich zu bekannten Mechanismen, wie die Verringerung der Gallensalz-Synthese in der Leber ^11. Dieser Entwicklungsprozess in Meerneunauge bietet die einzige bekannte Möglichkeit, das Fortschreiten der Gallengangsatresie zu untersuchen.

Eine neu entwickelte Methode namens "Klarheit" ermöglicht hochauflösende Bildgebung in komplexen Nervensystem von Säugetieren durch die Umwandlung intakten Gewebe in einem optisch transparenten nanoporöse ^Hydrogel-12. Mit Meerneunauge Leber und eine modifizierte CLARITY-Protokoll können intakte Gewebe-Bildgebung der Leber und Gallen Degeneration ganzen Metamorphose dokumentiert werden.

Protokoll

1. Herstellung der Lösung

1. Auffüllen auf 1 l 10x 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4): Gewicht 26,2 g Natriumphosphat (einbasischen), 115 g Natriumphosphat (dibasisches) und 87,66 g NaCl. Löst in etwa 800 ml destilliertem H ₂ O, pH-Einstellung und bringt das Volumen auf 1 l mit destilliertem H ₂ O.
   1. Stellen Sie 1 L 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4): Nehmen Sie 100 ml 10x PBS, und fügen Sie 900 ml destilliertem H ₂ O.
   2. Stellen Sie 1 L 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 0,1% Triton X-100: Nehmen Sie 100 ml 10x PBS, 1 ml Triton X-100, und bringen das Volumen auf 1 L mit destilliertem H ₂ O.
2. Auffüllen auf 1 l 10x 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH 7,4): Gewicht 26,2 g Natriumphosphat (einbasischen) und 115 g Natriumphosphat (dibasisches). Löst in etwa 800 ml destilliertem H ₂ O, pH-Einstellung und bringt das Volumen auf 1 l mit destilliertem H ₂ O.
   1. Stellen Sie 1 L 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4): Nehmen Sie 100 ml 10x PB,und fügen Sie 900 ml destilliertem H ₂ O.
   2. Stellen Sie 1 L 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 0,1% Triton X-100: Nehmen Sie 100 ml 10x PB, 1 ml Triton X-100, und bringen das Volumen auf 1 L mit destilliertem H ₂ O.
3. Machen 400 ml Hydrogel-Monomer-Lösung (4% Acrylamid, 0,25% Bis-Acrylamid, 4% Paraformaldehyd, 0,0075% Ammoniumpersulfat, 0,0005% Saponin in 0,1 M PBS): Man wiegt 0,3 g Ammoniumpersulfat und 0,2 g Saponin. Add 210 ml destilliertem H ₂ O, 40 ml 40% Acrylamid, 10 ml 2% Bis-Acrylamid, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% igem Paraformaldehyd, und gut mischen.
4. Stellen 4 L Clearing-Lösung (4% SDS in 0,2 M Borsäure): Wiegen 49,464 g Borsäure und 160 g SDS. Löst in etwa 3,5 L destilliertem H ₂ O, pH auf 8,5 mit NaOH, und bringen das Volumen bis zu 4 L.
5. Stellen Sie 1 L 80% Glycerin-Lösung: Messen 800 ml Glycerin, 200 ml destilliertem H ₂ O, und gut mischen.

2. Gewebepräparation

1. Hydrogel-Monomer-Lösung herzustellen, und 10 ml Aliquots zu je 15 ml Zentrifugenröhrchen.
2. Präparieren Sie die ganze Gewebe und zu beheben in dem Hydrogel für 2 Tage bei 4 ° C Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel-Lösung mindestens 10-fache Volumen des Gewebes.
3. Bringen Sie die Hydrogel-fixierten Gewebe (in der 15-ml-Zentrifugenrohr) zu einem Abzug.
4. Polymerisieren das Hydrogel fixiertem Gewebe durch Zugabe von 5 ul TEMED, gut mischen, und lassen Sie sich im Abzug bei Raumtemperatur für 2-3 Stunden.
5. Entfernen Sie das überschüssige Gel gründlich. Hinweis: Extra-Gel wird den Clearing-Prozess und den Antikörper Penetration während der Färbung zu verhindern.
6. Inkubieren Sie die fixierten Gewebe in 10 ml Clearing-Lösung in einem Inkubator Schüttler bei 70 rpm und 50 ° C eingestellt, für einige Tage, bis das Gewebe wird transparent. Ändern Clearing-Lösung mindestens einmal pro Tag und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Clearing-Lösung.
7. Spülen des Gewebes in 10 ml 0,1 M PB mit 0,1% Triton X-100 bei 70 rUhr und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Pufferlösung.
8. Inkubieren der geklärten Gewebe in der primären Antikörperlösung in PB mit 0,1% Triton X-100 bei 70 rpm und 37 ° C für 2 Tage. Hinweis: Stellen Sie genug primären Antikörperlösung, die ganze Gewebe einzutauchen.
9. Mit 0,1% Triton X-100 spült das Gewebe in 10 ml PB bei 70 rpm und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Pufferlösung.
10. Führen Sie die folgenden Schritte in einem dunklen Raum oder unter schwachem Licht. Decken Sie die Proben mit Folie auf ein Foto, Bleich verhindern.
11. Inkubieren der geklärten Gewebe mit dem fluoreszierenden Zweitantikörper-Lösung in PB mit 0,1% Triton X-100 und der Blockierungsserum bei 70 rpm und 37 ° C für 1 Tag.
12. Mit 0,1% Triton X-100 spült das Gewebe in 10 ml PB bei 70 rpm und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel from das Gewebe beim Wechsel der Pufferlösung.
13. Spülen Sie das Gewebe in 10 ml PBS bei 70 min und 37 ° C über Nacht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und entfernen Sie das überschüssige Gel aus dem Gewebe, wenn die Änderung der Pufferlösung.
14. Inkubieren geklärt Gewebe in 80% Glycerin bei 70 min und 37 ° C über Nacht.
15. Bewahren Sie die fluoreszierenden Buntgewebe bei 4 ° C vor der konfokalen Mikroskopie.

Ergebnisse

Mehrere wichtige Entwicklungsschritte in der Leber-Gallen-System auftreten, während das Meerneunauge Metamorphose. Der Gallengang und die Gallenblase Apoptose und entarteten (Abbildung 1). Kombinieren des modifizierten Klärungsverfahren und Färbung mit Leberzellmarker Cytokeratin 19 (CK19, sowohl Cholangiozyten-und Hepatozyten vor und nach der Metamorphose ¹³ vorhanden) und anti-apoptotischen Bcl-2-Marker mittels konfokaler Mikroskopie wurde die gesamte Gallensystems entlang der Z-Achse (f...

Diskussion

Dieses Protokoll wird von einer neuen Methode namens "Klarheit" ^12, die intakten Gewebes mit Polyacrylamid vernetzt, um ein nanoporöses Hydrogel zu bilden, und streift die Plasmamembran des Gewebes, um optische Transparenz und Durchlässigkeit zu erreichen makromolekularen dann modifiziert. "CLARITY" können intakte Gewebe Bildgebung von Langstrecken-Projektion und lokale Verdrahtung im Nervensystem. Diese neue Methode kann verwendet werden, um die gesamte Gallensystems in Meerneunauge Le...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G
boric acid	Sigma	B7901-1KG
saponin	Sigma	47036
sodium dodecyl sulfate	Sigma	L337-500G
sodium phosphate (monobasic)	Sigma	04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glycerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
NaOH pellets	EMD	SX0590-3
15 ml centrifuge tubes	Any brand
dissecting tools	Any brand