Новый Разъяснение Метод визуализировать Желчная дегенерации Во печени Метаморфозы в море Минога ( Petromyzon Маринус)

Резюме

Море минога потерять желчный пузырь и желчные протоки во время метаморфоза, процесс, аналогичный атрезия желчных путей человека. Новый фиксация и метод разъяснения (ясность) был изменен, чтобы визуализировать весь желчевыводящих путей с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения желчных вырождение.

Аннотация

Атрезия желчевыводящих путей является редким заболеванием младенчества, по оценкам, 1 в 15 000 частоты в юго-восточной США, но чаще встречается у стран Восточной Азии, с отчетным частотой 1 на 5000 в Тайване. Хотя многое известно об управлении атрезия желчных путей, его патогенез до сих пор не удается. Море минога (Petromyzon Маринус) предоставляет уникальную возможность изучить механизм и прогрессирование желчных дегенерации. Море минога развивать через три различных стадиях жизни: личинок, паразитарных и взрослых. Во время перехода от личинок паразитических несовершеннолетнего, море минога претерпевают метаморфоз с драматическим реорганизации и реконструкции в внешней морфологии и внутренних органов. В печени, весь билиарной системы теряется, в том числе желчного пузыря и желчных протоков. Недавно разработанный метод называется "Clarity" был изменен, чтобы уточнить всю печень и слияния с кишечника в метаморфических моря миноги.Процесс желчных дегенерации визуализировали и различить во моря миноги метаморфозы с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения атрезия желчных путей в уникальном животной модели.

Введение

Море минога развивать через три различных этапам жизни ^1,2. Личинок морского минога (L) проводят больше всего времени в норах, как донных фильтраторов. Пройдя через семь метаморфических этапов драматических изменений во внешней морфологии и реорганизации в внутренних органов ^3, в результате несовершеннолетние (СП) введите паразитический этап, в течение которого они питаются кровью и тканевой жидкости из рыбы-хозяина, увеличивая массы тела более чем в 100 раз . После 1,0 до 1,5 лет, питающихся рыбы-хозяина в океане или крупных озер, взрослые перестают кормление во время ранней весной и мигрируют в реки на нерест, а потом умирают ^1,2.

Во время метаморфоза, море минога печени теряет желчный пузырь и весь желчных дерево, эволюционный мутантный фенотип, который имитирует человеческие болезни младенец атрезия желчных путей. Младенческая атрезия желчных путей является редким детской болезнью печени с тяжелыми осложнениями ^4,5,6,7, 8,9,10, однако патогенез и этиология атрезия желчных путей в значительной степени неизвестны ^4. Пациенты с атрезия желчных путей умирают в течение двух лет после рождения, если хирургическое вмешательство (процедура Касаи) не выполняется ^5. Впоследствии, эти пациенты требуют обширного клинического ведения и часто трансплантации печени ^6. Многие теории атрезия желчных путей этиопатогенезе были предложены, например, вирусной инфекции, врожденных пороков развития, аутоиммунного заболевания, и токсичных оскорбление. Тем не менее, вклад каждого в развитие атрезия желчных путей остаются неубедительными ^7,8,9,10.

В отличие от детей, которые страдают патологической атрезия желчных путей, море минога подвергаются умственно запрограммирован атрезия желчных путей без обширного некротического воспаления, фиброза или цирроза ^10. Животные могут страдать переходных холестаз во время этого процесса ^10, но адаптироваться к этому условию развитияDe Novo через синтез и секрецию солей желчных кислот в кишечнике после развития желчных атрезии, в дополнение к известных механизмов, таких как снижение синтеза желчных солей в печени ^11. Это развития процесса в морской миноги предоставляет единственный известный возможность изучить прогрессирование атрезия желчных путей.

Недавно разработанный метод называется "Clarity" позволяет с высоким разрешением изображения в сложных млекопитающих нервной системы путем трансформации неповрежденной ткани в оптически прозрачной нанопористой гидрогеля ^12. Использование море печень миноги и модифицированный протокол ясности нетронутыми тканей визуализации желчевыводящих дегенерации может быть документированы в течение метаморфоза печени.

протокол

1. Подготовка решения

1. Сделать 1 л 10x 0,1 М фосфатный буфер солевой раствор (PBS, рН 7,4): Взвешивают 26,2 г фосфата натрия (одноосновного), 115 г фосфата натрия (двухосновный) и 87,66 г NaCl. Растворите в около 800 мл дистиллированной H ₂ O, отрегулировать рН и довести объем до 1 л дистиллированной H ₂ O.
   1. Сделать 1 л 0,1 М фосфатного буфера растворе (рН 7,4): Возьмите 100 мл 10x PBS и добавьте 900 мл дистиллированной H ₂ O.
   2. Сделать 1 л 0,1 М фосфатного буфера растворе (рН 7,4) с 0,1% Тритон Х-100: Возьмите 100 мл 10x PBS, добавить 1 мл Тритон Х-100, и довести объем до 1 л дистиллированной H ₂ O.
2. Сделать 1 L 10x 0,1 М фосфатного буфера (PB, рН 7,4): Взвесить 26,2 фосфат г натрия (одноосновный) и 115 фосфат г натрия (двухосновный). Растворите в около 800 мл дистиллированной H ₂ O, отрегулировать рН и довести объем до 1 л дистиллированной H ₂ O.
   1. Сделать 1 L 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4): Возьмите 100 мл 10x PB,и добавить 900 мл дистиллированной H ₂ O.
   2. Сделать 1 L 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4) с 0,1% Triton X-100: Возьмите 100 мл 10x PB, добавить 1 мл Тритон Х-100, и довести объем до 1 л дистиллированной H ₂ O.
3. Сделать 400 мл гидрогель мономерного раствора (4% акриламида, 0,25% бис-акриламида, 4% параформальдегид, 0,0075% персульфат аммония, 0,0005% сапонина в 0,1 М PBS): Взвешивают 0,3 г персульфата аммония и 0,2 г сапонин. Добавить 210 мл дистиллированной H ₂ O, 40 мл 40% акриламида, 10 мл 2% бис-акриламида, 40 мл 10x PBS (рН 7,4), 100 мл 16% параформальдегид, и хорошо перемешать.
4. Сделать 4 L клиринговой решение (4% SDS в 0,2 М борной кислоты): Взвесить 49,464 г борной кислоты и 160 г SDS. Растворите в 3,5 л дистиллированной H ₂ O, отрегулировать рН до 8,5 с помощью NaOH, и довести объем до 4 L.
5. Сделать 1 л 80%-ного раствора глицерина: Измерьте 800 мл глицерина, добавить 200 мл дистиллированной H ₂ O, и хорошо перемешать.

2. Подготовка ткани

1. Подготовка гидрогеля раствор мономера и аликвоты 10 мл к каждому 15 мл центрифужную пробирку.
2. Проанализируйте всю ткань и закрепить в гидрогеля в течение 2 дней при 4 ° С. Убедитесь, что гидрогель решение, по крайней мере в 10 раз объем ткани.
3. Принесите гидрогеля фиксированную ткани (в 15 мл трубки центрифуги), чтобы вытяжной шкаф.
4. Полимеризации гидрогеля фиксированную ткань, добавив 5 мкл TEMED, хорошо перемешать, и пусть сидят в вытяжной шкаф при комнатной температуре в течение 2-3 часов.
5. Снимите лишний гель тщательно. Примечание: Очень гель будет препятствовать процесса клиринга и проникновение антител во время окрашивания.
6. Инкубируйте фиксированную ткани в 10 мл очистке раствора в инкубаторе шейкере при 70 оборотах в минуту и ​​50 ° С в течение нескольких дней, пока ткань не станет прозрачным. Изменение координационного решение, по крайней мере один раз в день и удалить избыток гель из ткани при изменении клиринговой решение.
7. Промыть ткань в 10 мл 0,1 М PB с 0,1% Triton X-100 в 70 гм. и 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
8. Инкубируйте осветленной ткани в первичном раствора антител в ПК с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение 2 дней. Примечание: Оставьте достаточно решение первичного антитела, чтобы погрузить весь ткани.
9. Промыть ткань в 10 мл PB с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
10. Выполните следующие действия в темной комнате или при слабом освещении. Обложка образцов с фольгой, чтобы предотвратить просмотром отбеливание.
11. Инкубируйте осветленной ткани с флуоресцентным вторичного раствора антител в ПК с 0,1% тритона Х-100 и блокирующего сыворотки при 70 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение 1 дня.
12. Промыть ткань в 10 мл PB с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток геля еПЗУ ткани при изменении буферный раствор.
13. Промыть ткань в 10 мл PBS при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
14. Инкубируйте осветленной ткани в 80% глицерине при 70 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С в течение ночи.
15. Хранить флуоресцентный окрашенных тканей при 4 ° С до конфокальной микроскопии.

Результаты

Несколько важных событий развития происходят в гепатобилиарной системы во время морской миноги метаморфозы. Желчных протоков и желчного пузыря подвергаются апоптозу и вырождаются (рис. 1). Объединение модифицированный метод осветления и окрашивания с печени клеточных марке?...

Обсуждение

Этот протокол изменение от нового метода, называемого "ясности" ^12, который сшивает интактной ткани с полиакриламида с образованием гидрогеля нанопористого, а затем убирает плазматическую мембрану ткани для достижения оптической прозрачности и макромолекул проницаемость. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G
boric acid	Sigma	B7901-1KG
saponin	Sigma	47036
sodium dodecyl sulfate	Sigma	L337-500G
sodium phosphate (monobasic)	Sigma	04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glycerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
NaOH pellets	EMD	SX0590-3
15 ml centrifuge tubes	Any brand
dissecting tools	Any brand